ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 2, с. 175-180
УДК 582.232+637.17
ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЧАЛА
© 2013 г. В. И. Голубев
Всероссийская коллекция микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, 142290 e-mail: wig@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 16.11.2011 г.
Обнаружен штамм клюйверомицетов, секретирующий фунгицидный токсин белковой природы. Наибольшая активность наблюдается при значении рН среды 5.0 и повышенном осмотическом давлении. Данный агент отнесен к микоцинам, действует против видов рода Kluyveromyces и некоторых представителей таксономически родственных им таксонов.
DOI: 10.7868/S0555109913010066
Дрожжи нередко могут выступать в качестве антагонистов различных микроорганизмов. Такая их активность бывает обусловлена разными причинами: подкислением среды, накоплением в ней этанола, образованием хелатизирующих соединений, гликолипидов, микоцинов (киллер -токсины) [1]. Последние представляют собой белковые вещества, действующие против таксономически родственных микоциногенным штаммам организмов. Помимо теоретических мико-циногении посвящено немало и прикладных исследований, предлагающих использовать данное явление в целях конструирования устойчивых стартовых культур для бродильной промышленности, биотипирования запатентованных и патогенных штаммов, биоконтроля фитопатогенных и вызывающих порчу пищевых продуктов и кормов грибов.
К настоящему времени микоциногенные штаммы обнаружены у представителей почти всех родов дрожжевых грибов, включая Kluyveromyces van der Walt [2—5]. За исключением K. lactis (Dombrowski) van der Walt [6], у которого изучены и генетические детерминанты синтеза микоцина, строение и механизм его действия, такие штаммы других видов клюйверомицетов исследованы обычно лишь в каком-либо одном аспекте.
Микоциногенная активность обнаружена нами у штамма клюйверомицета, выделенного из чала, туркменского кисломолочного напитка, образующегося из верблюжьего молока в результате молочнокислого и спиртового брожения. В процессе роста микроорганизмы обогащают среду продуктами своего метаболизма [7]. Этому напитку приписывают целебные свойства и в некоторых районах Туркмении проводят курсы лечения чалом. Он используется при лечении туберкулеза и заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Цель работы — выяснение условий проявления антифунгальной активности, характеристика микоцина, секретируемого штаммом ВКМ Y-451, и установлению спектра его действия.
МЕТОДИКА
Штаммы. В работе использованы культуры Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, http://www.vkm.ru). Подавляющая часть обследованных видов представлена их типовыми штаммами, а родов — типовыми видами. Исследованный в настоящей работе штамм ВКМ Y-451 поступил в коллекцию в 1948 г. от М.Ф. Цыганкова (АН Туркменской ССР). В.И. Кудрявцев отнес данный штамм к виду Saccharomyces lactis Adametz, рассматривая наименование S. lactis Dombrowski в качестве синонима [8]. Позднее он был переименован как Kluyveromyces lactis (Dom-browski) van der Walt, а недавно на основании ре-стрикционного анализа некодирующих участков рДНК реидентифицирован как K. marxianus (Hansen) van der Walt [9]. В отличие от неотипового штамма и стандартного описания этого вида [10] ВКМ Y-451 не растет при +37°С, сбраживает трегалозу, инулин не сбраживает.
Тестирование чувствительности. Чувствительность трехсуточных культур, выращенных на сусло-агаре (СА) при комнатной температуре, тестировали методом "культура против культуры". Водную суспензию обследуемого на чувствительность штамма (0.05 мл, 105 кл./мл) тщательно растирали шпателем по поверхности агаризованной среды подобранного состава (см. ниже). Затем штрихом наносили на нее обильный инокулюм штамма BKM Y-451. Чашки инкубировали при комнатной температуре до появления роста газона. При наличии вокруг штриха зоны подавления роста в несколько мм тестируемые штаммы реги-
%
100 80 60
40 -
20 -
10
ч
Гибель клеток Saccharomyces bayanus ВКМ У-523 (% от исходной концентрации 1.2 х 103 кл./мл) при инкубации в токсинсодержащей культуральной жидкости штамма ВКМ У-451.
стрировали как чувствительные, при отсутствии зоны — как нечувствительный. При образовании узкой зоны, около 1 мм, штаммы относили к слабо чувствительным.
Получение и характеристика токсина. Для наработки токсина штамм BKM Y-451 выращивали в жидкой среде в покое 3 сут. Клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 10 мин) и суперна-тант фильтровали через стеклянные фильтры GF/A ("Sigma", США). Полученную токсин-со-держащую культуральную жидкость использовали для установления действия токсина на жизнеспособность чувствительных клеток, которую при инкубации в ней определяли высевами на СА. Она использована также для проверки устойчивости токсина к повышенной температуре и протеолизу методом лунок в агаре. Для ориентировочной оценки молекулярной массы токсина штамм BKM Y-451 выращивали на покрытой диализной мембраной ("Spectrum", США) среде для тестирования чувствительности. После 7 сут инкубации мембрану вместе с выросшей на ней культурой удаляли и поверхность среды засевали газоном чувствительного к токсину штамма Sac-charomyces cerevisiae BKM Y-443.
Элиминация антифунгальной активности. Водную суспензию (0.1 мл, 104 кл./мл) штамма ВКМ Y-451 высевали газоном на СА и инкубировали при максимальной для его роста температуре. Другие чашки 3 мин облучали УФ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Антифунгальная активность штамма ВКМ У-451 проявляется при кислых значениях рН среды и не обнаруживается уже при рН 6.0. Наибольшие по ширине зоны подавления роста чувствительных культур наблюдали при рН 5.0 (цитрат-
фосфатный буфер). Ширина этих зон вокруг штриха штамма ВКМ Y-451 возрастала при введении в среду глицерина или NaCl. Наибольшей она была при содержании глицерина 100—150 мл/л или концентрации соли 4%. Дальнейшее повышение содержания в среде глицерина и NaCl приводило к замедлению или даже отсутствию роста газона. В итоге тестирование чувствительности основной массы культур к антифунгальному агенту штамма ВКМ Y-451 осуществлено на среде следующего состава (г/л): глюкоза — 5.0, пептон — 2.5, дрожжевой экстракт - 2.0, NaCl - 40.0, Na2HPO4 - 7.31, моногидрат лимонной кислоты — 5.10, агар — 20.0, рН — 5.0. Штаммы, чувствительные к повышенному содержанию соли, тестировали при меньших концентрациях NaCl.
При наличии в среде метиленового синего (0.03 г/л) по границе зоны подавления роста на газоне возникала синяя кайма, что свидетельствовало об отмирании клеток чувствительного штамма. Фунгицидное действие подтвердили данные об их гибели в процессе инкубации в культуральной жидкости штамма ВКМ Y-451 (рисунок).
Для получения токсина данный штамм выращивали в среде указанного выше состава, исключив NaCl и агар, но с добавлением глицерина (100 мл/л) и содержании глюкозы 20.0 г/л.
Агент, секретируемый штаммом BKM Y-451, полностью инактивируется после выдерживания при 100°С (5 мин), а также после обработки пепсином ("Serva", Германия). Он не диффундирует через диализную мембрану, не пропускающую соединения с молекулярной массой 6—8 кДа и более.
Судя по результатам проверки более 160 случайно отобранных колоний, инкубация этого штамма при максимальной для его роста температуре (34°С, СА) и облучение УФ (выживаемость при этом составляла менее 1%) не приводили к утрате антифунгальной активности.
Токсин штамма BKM Y-451 не действует на какие-либо из обследованных 92 видов 41 рода ба-зидиомицетных дрожжевых грибов. К нему также нечувствительны 87 видов 48 родов аскомицет-ных дрожжей (табл. 1). Он активен против клюй-веромицетов, все виды которых, включая их ана-морфы (Candida sphaerica, C. kefyr), к нему чувствительны (табл. 2). Исключения составляли единичные штаммы K. lactis и K. marxianus.
Несколько видов рода Saccharomyces Meyen ex Reess, таксономически близкие клюйверомице-там, также чувствительны к данному токсину (табл. 3). Подавляющее большинство культур типового вида рода, S. cerevisiae Meyen ex Hansen, включая неотиповой штамм вида и типовой штамм его анаморфы, C. robusta, к нему устойчивы. Однако типовые штаммы видов S. chevalieri Guilliermond (syn. S. lindneri Guilliermond) и
ФУНГИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЧАЛА 177
Таблица 1. Дрожжи, нечувствительные к микоцину К1иууегошусе8 шатапт ВКМ У-451 (цифры в скобках указывают количество обследованных видов, штаммов)
Aciculoconidium (1, 1) Kondoa (1, 1) Schizoblastosporion (1, 13)***
Agaricostilbum (1, 1) Kregervanrija (1, 1) Schizosaccharomyces (1, 1)
Ambrosiozyma (1, 1) Kurtzmanomyces (1, 1) Schwanniomyces (6, 8)
Barnettozyma (3, 15) Kwoniella (1, 1) Sebacina (1, 1)
Bensingtonia (1, 1) Leucosporidiella (1, 1) Sirobasidium (1, 1)
Bullera (1, 1) Leucosporidium (1, 1) Sporidiobolus (4, 4)
Bulleromyces (1, 1) Lipomyces (3, 7) Sporobolomyces (14, 21)
Candida (5, 6)* Lodderomyces (1, 1) Sporopachydermia (1, 1)
Citeromyces (1, 1) Magnusiomyces (1, 1) Starmera (2, 3)****
Clavispora (1, 1) Mastigobasidium (1, 1) Sterigmatomyces (1, 1)
Cryptococcus (1, 1) Metschnikowia (8, 13) Sugiyamaella (1, 1)
Cuniculitrema (1, 1) Meyerozyma (1, 1) Sympodiomycopsis (1, 1)
Curvibasidium (1, 1) Millerozyma (1, 1) Tausonia (2, 2)
Cystofilobasidium (1, 1) Mrakia (1, 1) Tetrapisispora (2, 2)
Debaryomyces (1, 1) Mrakiella (1, 1) Tilletiopsis (1, 1)
Dioszegia (1, 1) Myxozyma (1, 1) Torulaspora (4, 4)
Dipodasopsis (1, 1) Nadsonia (2, 13) Tremella (1, 1)
Eremothecium (1, 1) Nakazawaea (1, 4) Trichomonoascus (1, 1)
Fellomyces (1, 1) Nakaseomyces (1, 1) Trichosporon (1, 1)
Erythrobasidium (1, 1) Naumovozyma (1, 1) Trigonopsis (1, 1)
Fibulobasidium (1, 1) Peterozyma (1, 1) Trimorphomyces (1, 1)
Filobasidiella (1, 1) Pichia (1, 1) Udeniomyces (1, 1)
Filobasidium (1, 1) Priceomyces (4, 10)** Wickerhamia (1, 1)
Hanseniaspora (1, 1) Pseudozyma (1, 1) Wickerhamiella (1, 1)
Holtermannia (1, 1) Rhodosporidium (8, 23) Xanthophyllomyces (1, 1)
Hyphopichia (2, 2) Rhodotorula (28, 37) Yamadazyma (1, 1)
Itersonilia (1, 1) Saccharomycopsis (1, 1) Yarr
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.