ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 2, с. 149-162
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 575.1
ФУНКЦИИ БЕЛКА MTS1 (S100A4) В НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
© 2008 г. Ю. А. Кошелев, Г. П. Георгиев, А. В. Кибардин
Институт биологии гена Российской академии наук, Москва 119334; e-mail: yakoshelev@mail.ru Поступила в редакцию 25.07.2007 г.
В настоящее время накоплено немало фактов, подтверждающих роль белка MTS1 в формировании метастазов и в регуляции клеточной подвижности как в норме, так и при развитии патологических изменений в различных тканях. Хорошо изучена структура белка и кодирующего его гена, а также регуляция экспрессии данного гена. Наметился большой прогресс в изучении молекулярных механизмов с участием MTS1. Данная статья представляет собой обзор современного состояния научных знаний по этим вопросам.
СВЯЗЬ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА МТБ1 С МЕТАСТАЗИРОВАНИЕМ ОПУХОЛЕЙ
Сегодня осталось не так много белков, играющих ключевую роль в канцерогенезе, для которых не выявлены молекулярные механизмы их участия в этом процессе. Один из таких примеров представлен в этом обзоре - это белок МТБ1 (8100А4), являющийся одним из маркеров и индукторов метастатического фенотипа опухолевых клеток. Около 20 лет назад кДНК гена, кодирующего белок Б100А4, была независимо из различных видов млекопитающих клонирована несколькими научными группами и как следствие сам ген и белок имеют несколько названий: мета-стазин-1 (МТБ1), рБЬ98, р9Ка, 42А, Б100А4, САРЬ и кальваскулин [1-9].
Экспрессия нового гена интенсивно изучалась в контексте его влияния на метастатический потенциал опухолевых клеток, и, как оказалось, по прошествии десятка лет первоначальное название метастазин-1 (МТБ1) было дано в одной из лабораторий очень удачно [1]. Многочисленные им-муногистохимические исследования уровня экспрессии Б100А4 достоверно показали его увеличение в различных видах опухолей человека и прямую связь высокого уровня экспрессии этого гена с частотой метастазирования таких опухолей и низким процентом выживших пациентов. Так, например, при исследовании 350 первичных опухолей на 1-й и 2-й стадиях рака легкого на наличие в них белка Б100А4 [10, 11] была установлена высокая степень корреляции (Р < 0.0001) между уровнем экспрессии данного белка и смертностью пациентов в течение 19 лет. Выживали 80% пациентов, чьи опухоли не экспрессирова-ли Б100А4, и лишь 11% пациентов - при наличии Б100А4. Связь экспрессии белка Б100А4 и метастазирования была показана для немелкоклеточного
рака легкого [12], рака предстательной железы [13], рака мочевого пузыря [14], аденокарциномы поджелудочной железы [15], первичного рака желудка [16], для некоторых меланом [17] и др.
При анализе изменений уровня генной экспрессии в клетках аденокарциномы поджелудочной железы были проскринированы кДНК 7 746 генов[18] и был обнаружен существенно (в 40 раз) более высокий уровень экспрессии гена S100A4 относительно нормальных клеток. Аналогичные результаты были получены в эксперименте по скринингу 9 932 различных кДНК из клеточных линий агрессивных метастазирующих опухолей поджелудочной железы [19], а также в аналогичных экспериментах с опухолями иного происхождения [20]. Наконец, используя протеомный подход, был выявлен более высокий уровень экспрессии белка S100A4 в метастазирующих линиях гепатокарциномы по сравнению с неметастазиру-ющими линиями того же происхождения [21].
Опыты с использованием генно-инженерных конструкций на опухолевых клеточных линиях также показали связь между экспрессией S100A4 и приобретением метастатического фенотипа раковыми клетками. Введение конструкций, экс-прессирующих S100A4, в клетки неметастазиру-ющей опухоли молочной железы крысы при подкожных инъекциях их в здоровое животное приводило к формированию такими клетками метастазов [22]. В экспериментах с клетками легочной карциномы Льюиса, обладающими высокой способностью давать метастазы, было обнаружено резкое снижение их инвазивности in vitro после введения в них конструкции, экспрессирующей РНК, ингибирующую трансляцию S100A4 [23].
Эксперименты с трансгенными мышами также подтверждают рассматриваемую гипотезу. У мышей с введенной в геном конструкцией, экс-
NFkB p200/KRC + - \+ + + +
New Ap-1 Msbp CBF Ap-1 (Fra/JunD)
Рис. 1. Расположение регуляторных элементов в первом интроне гена mtsl.
прессирующей S100A4 под контролем специфического для молочной железы вирусного промотора, наблюдался нормальный фенотип, но при скрещивании их со штаммом GRS/A, для особей которого характерна высокая частота образования опухолей молочной железы, редко дающих метастазы, получалось потомство, страдающее метаста-зирующими опухолями молочной железы [24].
Приведенные факты убедительно доказывают, что белок метастазин-1 (MTS1), обозначаемый как S100A4, CAPL, pEL98, 18А2, p9Ka, 42A, CAPL, кальваскулин, является одним из индукторов формирования метастатического фенотипа опухолевых клеток.
БЕЛОК S100A4/MTS1 -ПРЕДСТАВИТЕЛЬ СЕМЕЙСТВА S100
Белки семейства S100 представляют собой маленькие (10-12 кДа), связывающие ионы кальция молекулы, существующие в виде нековалентных параллельных (для членов семейства, чья трехмерная структура была установлена) гомодиме-ров (S100A4) [25]. Полипептид S100A4 состоит из 101 аминокислотного остатка (а.о.). Некоторые представители семейства могут образовывать ге-теродимеры: S100A4/S100A1, S100A8/S100A9, S100A6/S100B, S100A1/S100P и т.д. Вторичная структура для всех членов семейства однотипна и сформирована четырьмя а-спиралями, соединенными петлями сравнимой длины. Главная особенность, присущая только этому семейству каль-ций-связывающих белков, состоит в наличие двух связывающих ионы кальция доменов (на мономер) типа EF-руки, одна из которых типична для ряда других семейств и состоит из 12 аминокислотных остатков (Kd = 10-50 мкМ) [25], располагаясь ближе к С-концу мономера, а другая, находящаяся на N-конце, состоит из 14 аминокислотных остатков и считается псевдо-EF-рукой, связывающей ионы кальция гораздо менее прочно (Kd = 200-500 мкМ). Псевдо-EF-рука сформирована петлей между а-спиралями 1 и 2, а каноническая EF-рука - петлей между а-спиралями 3 и 4 [25]. Первичная последовательность белков семейства S100 идентична на 25-65%, в зависимости от сравниваемой пары белков. Основная масса различий находится в линкере, соединяющем EF-руки, и на протяженном С-конце. Связывание
ионов кальция псевдо-EF-рукой приводит лишь к незначительным конформационным изменениям в структуре молекулы S100, тогда как связывание ионов кальция канонической EF-рукой приводит к повороту спирали 3 относительно спирали 4 и делает более доступными гидрофобные аминокислотные остатки спиралей 3 и 4, а также протяженного С-концевого региона. Гидрофобные остатки в петле 4, особенно F72, Y75, F78 и L79, важны для формирования интерфейса димериза-ции, которая происходит in vitro c Kd = 1-2 мкМ [26]. Для S100A4 C-концевой регион существенно отличается по первичной последовательности от такового у других членов семейства S100 и, по-видимому, имеет наибольшее значение для узнавания специфического для S100A4 набора белков-мишеней [27].
СТРУКТУРА ГЕНА S100A4 И РЕГУЛЯЦИЯ ЕГО ЭКСПРЕССИИ
Из 25 обнаруженных на сегодня у человека генов семейства S100 21 (S100A1-S100A18, trichohy-lin, filaggrin и repetin) образует кластер, находящийся в хромосомном локусе 1q21. В геноме мыши аналогичный кластер генов находится в локусе 3f3. Ген S100A4 находится между генами S100A3 и S100A5. Секвенирование гена mtsl человека показало, что он состоит из трех интронов и четырех экзонов, из которых первые два не кодируют аминокислотной последовательности, а у мыши ген mtsl состоит из трех экзонов и двух интронов [28]. Первый экзон гена mtsl у мыши мал и тоже не кодирует транслируемой последовательности, а все цис-регуляторные элементы были найдены в первом интроне (рис. 1). Среди них оказались как хорошо известные негативные и позитивные регуляторы, так и новые регулятор-ные элементы [29-31].
Оказалось, что первый элемент АР-1 метилирован в клетках неметастазирующей линии CSML-0, не экспрессирующих MTS-1, и представляет собой в метилированном состоянии негативный регуляторный элемент умеренной силы, связывающий белки семейства Jun и Fos [30]. В клетках линии СSML-100, обладающих высокой способностью давать метастазы и высоким уровнем экспрессии MTS-1, этот сайт не метилирован и не активен [30]. Непосредственно перед сайтом АР-1 был обнаружен защищенный в клетках линии СSML-100, но не в клетках линии СSML-0, участок длиной в 16 пн, обладающий энхансерной активностью [29]. Однако связывающиеся с этим участком белки не были идентифицированы.
Основной регуляторный элемент, в 40 раз повышающий уровень экспрессии репортерного гена, находящийся в первом интроне между нуклео-тидами +780 и +916, представляет собой сложную мозаику сайтов, обладающих разнонаправлен-
789 _ 798 „
I кВ | Sa
gcagctggggtttttcCacttttttttgtctgcct|ctgggcaggcag|c
I I I
+782
817
828
Sp1-I Ap-2
Sp1-II
gcagccgcgcccaacgctgggagggagaagaatgggccagggccagggcct
835
I I 841 844
848
858
CBF
Sp1-III Ap-1
ggtgcttgtggttgagctgtgggagtgagtaagctgatgg II lili I
883
889
896
902 905 908
+916
Рис. 2. Строение основной части регуляторного элемента, расположенного в первом интроне гена mts1 [32].
ным влиянием на уровень экспрессии гена mtsl (рис. 2) [32].
Первым на этом участке расположен элемент, подобный по своей последовательности сайту для NF-кВ. Этот сайт действительно связывает гете-родимеры белков NF-KB/Rel: p50/p50 и p50/p65, а также белок р200 [31]. Однако введение точечных замен в этот сайт, отменяющих связывание белков NF-KB/Rel: p50/p50 и p50/p65, не влияло на активность энхансера, тогда как мутации, отменяющие связывание белка р200, лишали этот элемент энхансерной активности, причем in vivo данный сайт был защищен только в клетках линии CSML-100, но не в клетках линии CSML-0, не экс-прессирующих MTS1 [31]. Позднее было показано, что р200 представляет собой ДНК-связываю-щий белок (KRC) из семейства ZAS [33].
Через 10 пн от сайта связывания KRC расположен участок +810-839, обозначе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.