ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 4, с. 430-442
УДК 577.217.34/.36
ФУНКЦИИ КОРОТКИХ РЕГУЛЯТОРНЫХ РНК ^РНК) И БЕЛКА Piwi У ДРОЗОФИЛЫ
© 2015 г. B. A. Гвоздев, А. Д. Столяренко, М. С. Кленов
Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182
e-mail: gvozdev@img.ras.ru Поступила в редакцию 26.10.2014 г.
Короткие (25—35 нуклеотидов) регуляторные piPHK, вместе с РНК-связывающими белками семейства Piwi, составляют эволюционно консервативную систему, функционирующую главным образом в гонадах эукариот. Систему можно рассматривать как вариант механизма РНК-интерференции, в основе которого лежит узнавание мишени — РНК в результате комплементарных взаимодействий с piPHK. Варианты этой регуляторной системы функционируют как в клетках зародышевого пути, включая стволовые клетки, так и в окружающих соматических клетках ниши, обеспечивающих поддержание стволовых терминальных клеток и их дифференцировку. Одна из важных, но не единственная функция этой системы состоит в репрессии транспозонов, что гарантирует стабильность генома в клетках зародышевого пути. В настоящем обзоре сделан акцент на работы авторов обзора на фоне выдающихся мировых достижений в быстро развивающейся области исследований — "биологии piPHK" и функций белка Piwi.
DOI: 10.7868/S0016675815040050
Наши исследования, позволившие выявить роль короткой piPHK в подавлении экспрессии (сайленсинге) генов in vivo, относятся к тому времени, когда было открыто явление РНК-интерференции и получены первые указания на участие коротких РНК в подавлении экспрессии повторяющихся последовательностей в геномах эукариот. Эти работы были опубликованы в 1998—2000 гг., непосредственно перед тем, когда исследование сайленсинга повторов Stellate у дрозофилы привело нас к обнаружению piPHK.
ОТКРЫТИЕ ЯВЛЕНИЯ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ (РНКи)
Открытие РНКи было связано в первую очередь с обнаружением неожиданного эффекта подавления экспрессии мРНК у нематоды с помощью гомологичной двунитевой РНК, при попытках снизить экспрессию генов с помощью антисмысловой РНК [1]. Репрессорный эффект двуцепочечной РНК оказывался значительно сильнее, чем антисмысловой РНК. Однако механизм действия двунитевой РНК оставался непонятным, и в этих экспериментах обнаружить предполагаемый репрессорный агент — антисмысловую РНК, комплементарную мРНК, не удавалось. Вслед за этой работой, при исследовании подавления экспрессии трансгенов у табака удалось идентифицировать короткую антисмысловую РНК (25 нуклеотидов), которая рассматривалась авторами как стабильный интермедиат сайленсинга, узнающий смысловую РНК [2]. Ав-
торы предположили, что короткая РНК синтезируется на мРНК трансгена. Несколько позднее они обнаружили у растений ген, ответственный за сайленсинг трансгенов и кодирующий РНК-зависимую РНК-полимеразу, способную синтезировать антисмысловую РНК [3]. Биохимические исследования на дрозофиле блестяще подтвердили представления о роли короткой РНК в сайленсинге: была показана способность экстрактов клеток дрозофилы расщеплять с участием эндонуклеазы Dicer двунитевую РНК с образованием коротких РНК (21—23 нуклеотида) и было выявлено участие антисмысловой короткой РНК в деградации мРНК [4, 5]. Короткая РНК, ответственная за сайленсинг с участием механизма РНК-интерференции, получила название siРНК (small interfering RNA).
Отметим, что за десять лет до этих исследований у растений было открыто явление косупрес-сии, заключающееся в парадоксальном подавлении экспрессии трансгенов при увеличении их числа в геноме. Наиболее эффектно косупрессия выглядела у петуньи, где ее проявление выражалось в резком снижении окраски цветка вследствие снижения содержания мРНК, ответственной за синтез ключевого фермента биосинтеза антоциана [6]. К расшифровке механизма косу-прессии удалось подойти заметно позднее, когда стало ясным участие в этом процессе РНК-зависимой РНК-полимеразы, использующей в качестве матрицы аномальные транскрипты трансгенов, а также была выяснена возможность образо-
вания двуцепочечной РНК при гибридизации смысловых и антисмысловых транскриптов трансгенов [7, 8].
ПОВТОРЫ STELLATE И КОРОТКИЕ РНК
Обнаружение мобильных элементов в геноме дрозофилы в зарубежном исследовании [9] и независимо в работах, выполненных совместно лабораторией Г.П. Георгиева и нашей лабораторией [10, 11], инициировало интерес к клонированию районов генома, содержащих эти элементы. В нескольких полученных клонах, включающих транспозон mdgl и гетерохроматиновые повторы конститутивного хроматина Х-хромосомы и Y-хромосомы [12], были обнаружены фрагменты открытых рамок трансляции белка, что поставило задачу поиска в конститутивном гетерохроматине нового гена, кодирующего белок. Гомология этих последовательностей так называемым повторам Stellate, локализованным в эухроматине Х-хромо-сомы, стала очевидной после публикации работы K. Livak, осуществившего секвенирование этих повторов [13]. В этой работе также было показано, что в Y-хромосоме локализованы транскрибируемые паралоги повторов Stellate и предполагалось, что они могут выступать как супрессоры Stellate, поскольку в отсутствие Y-хромосомы наблюдалась избыточная экспрессия генов Stellate, сопровождавшаяся стерильностью самцов. Эти повторы в Y-хромосоме, получившие название Suppressor of Stellate, или Su(Ste), стали рассматриваться как возможные репрессоры генов Stellate [13]. Вскоре мы опубликовали совместную с K. Livak работу, описывающую структуры повторов Su(Ste) как псевдогенов Stellate [14]. Репрессия повторов Stellate при участии гомологичных повторов Su(Ste) сопоставлялась нами с явлением косупрессии у растений и гриба Neurospora crassa — сайленсинга повторов, вызванного накоплением в геноме одинаковых трансгенных конструкций. Механизм косупрессии пока также оставался невыясненным. Принципиальным шагом в понимании механизма супрессии генов Stellate стала работа, в которую решающий вклад внес А.А. Аравин [15], в настоящее время известный автор работ, посвященных исследованию системы сайленсинга с участием piРНК как у дрозофилы, так и у млекопитающих. Было установлено, что транскрипты повторов Su(Ste) являются предшественниками коротких РНК размером 25—27 нуклеотидов, комплементарных транскриптам Stellate. В этой работе механизм сайленсинга генов Stellate мы расценивали как РНКи и отмечали, что эта модельная система впервые демонстрирует случай косупрессии, возникающей в эволюции генома в норме и не являющейся результатом искусственных манипуляций с трансгенными конструкциями [15]. В работе [15] и позднее [16] отмечалось,
что короткие Su(Ste) РНК длиннее, чем короткие интерферирующие siPHK (21—23 н), образующиеся из двунитевых РНК в экстрактах дрозофилы in vitro при участии эндонуклеазы Dicer [5], и предполагалось, что процессинг коротких Su(Ste) РНК может осуществляться в семенниках особым образом. Затем в работе, выполненной Аравиным в лаборатории Т Тушла, были описаны короткие rasi (repeat-associated small interfering) РНК размером 25—29 нуклеотидов, комплементарные транспозо-нам и гетерохроматиновым сателлитным повторам [17]. Авторы предполагали, что rasiРНК могут участвовать в транскрипционном сайленсинге гетерохроматиновых повторов. Вскоре в нашей совместной работе с лабораторией Р. Zamore было показано, что ни одна из двух известных форм эн-донуклеазы Dicer дрозофилы не нужна для образования короткой rasiРНК Su(Ste) [18]. Более того, оказалось, что эти РНК происходят в основном из антисмысловой цепи (комплементарной по отношению к мРНК Stellate). Таким образом, возникло предположение, что rasiРНК образуются не путем процессинга двуцепочечных транскриптов, как siРНК в процессе искусственной РНК-интерференции, а при нарезании одноце-почечных транскриптов-предшественников. В результате появилось представление о существовании у дрозофилы третьего типа сайленсинга с участием особого типа коротких — rasiРНК (позже переименованных в piРНК), отличающегося от двух уже установленных механизмов сайлен-синга, оперирующих с 21—23 нуклеотидными микроРНК или с короткими интерферирующими siРНК [19]. В той же работе [18] была продемонстрирована ассоциация rasiРНК, комплементарной последовательности ретротранспозона, с белком Piwi. Одновременно у мышей были найдены экспрессирующиеся в ходе сперматогенеза короткие РНК (26-31 нуклеотидов), связанные с белками семейства Piwi, которые в отличие от микроРНК и siРНК было предложено обозначать как piРНК [20, 21].
Причины губительного воздействия белка Stellate на процессы мейоза в сперматоцитах, сопровождающегося нарушениями компактизации и сегрегации хромосом [22], остаются невыясненными, как и возможная нормальная функция этого белка при отсутствии его гиперэкспрессии. Однако попытки выяснить эти вопросы позволили Л.В. Олениной показать физическое взаимодействие белка Stellate, первоначально описанного как гомолог регуляторной р-субъединицы про-теинкиназы СК2 [13], с каталитической а-субъединицей [23]. Поэтому предположили, что функция Stellate может состоять в модуляции активности СК2, мишенями которой являются белок хроматина НР1 и топоизомераза II. Другим неожиданным результатом этой же работы [23] явилось обнаружение способности антител к ги-
стону Н3 с триметилированным лизином в положении 9 узнавать белок Stellate, который, как оказалось, также содержит триметилированный лизин. Это наблюдение позволило предполагать, что белки-"читатели" этой репрессорной гетерохроматиновой модификации гистона Н3 могут узнавать и модифицированный Stellate. Другими словами, Stellate может вмешиваться в регуляцию модификации хроматина, конкурируя с белками-"читателями" этих модификаций. Оба эти наблюдения указывают на вероятную роль Stellate в формировании хроматина.
МОБИЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ (ТРАНСПОЗОНЫ), РНКи И р1РНК
Было показано [15], что мутации, активирующие экспрессию Stellate, приводят также и к дере-прессии транспозонов. При исследовании причин нарушения мейоза в сперматогенезе, вызванного гиперэкспрессией генов Stellate, было обнаружено, что мутация в гене spn-E/hls, несмотря на присутствие нормального кластера Su(Ste), вызывае
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.