МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 3, с. 371-385
== ОБЗОРЫ
УДК 577.218
ФУНКЦИИ р21™ В НОРМЕ И ПРИ СТРЕССОВЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ
© 2004 г. О. В. Тимофеев, Т. В. Поспелова, В. А. Поспелов*
Институт цитологии Российской академии наук, Санкт-Петербург, 194064 Поступила в редакцию 14.07.2003 г.
Один из представителей семейства ингибиторов циклин-зависимых киназ - р21тп/С1р1/8Й11/САР20 играет ключевую роль в остановке клеточного цикла на границе фаз 01/8 в ответ на повреждения ДНК. В то же время, известно его участие в сборке активных циклин-киназных комплексов, в частности циклин Б-С&4/6. Более того, как показали недавние исследования, его функции значительно шире. Помимо регуляции клеточного цикла р21тп принимает участие в важнейших биологических процессах клетки: дифференцировке, старении и апоптозе. По-видимому, в зависимости от состояния клетки - старения, воздействия стрессовых факторов, экспрессии вирусных онкогенов - баланс функциональной активности р21тп сдвигается в ту или иную сторону. Это достигается за счет прямого или опосредованного взаимодействия р21т с белками-модуляторами, а также в результате его модификаций - фосфорилирования или частичного протеолиза. В настоящем обзоре кратко изложены основные сведения о структуре р21тп и его посттрансляционных модификациях, обсуждаются данные о взаимодействиях этого белка с различными клеточными и вирусными белками и значение этих взаимодействий для функций р21п и клетки в целом.
Ключевые слова: ингибитор циклин-зависимых киназ р21тп, клеточный цикл, апоптоз.
ВВЕДЕНИЕ
Клетки высших организмов одновременно получают множество сигналов, одни из которых стимулируют пролиферацию, другие, напротив, являются антимитогенными. Такими сигналами могут быть внеклеточные факторы - гормоны, ростовые факторы, компоненты внеклеточного матрикса, физические взаимодействия с соседними клетками, а также внутриклеточные сигналы, возникающие при повреждениях ДНК или экспрессии онкогенов. Ответом нормальной клетки на повреждающие воздействия является остановка клеточного цикла в так называемых контрольных, или сверочных, точках. Ключевыми факторами, отвечающими за остановку клеточного цикла в точках Gj/S и G2/M, служат ингибиторы циклин-зависимых киназ (CKI). Уникальная особенность ингибиторов состоит в том, что их функциональная активность регулируется множеством подавляющих пролиферацию эндо- и экзогенных сигналов - контактным ингибировани-ем, терминальной дифференцировкой и старением клетки, антипролиферативными цитокинами, повреждением ДНК.
По структуре и набору мишеней ингибирова-ния CKI разделены на два семейства: INK4 (inhibitors of kinase 4), названные так за их способность специфически ингибировать Cdk4 и Cdk6, и семейство Cip/Kip (cyclin inhibitor protein/kinase inhibitor protein), члены которого подавляют актив-
* Эл. почта: vap@mail.cytspb.rssi.ru
ность циклин D-, E- и A-зависимых киназ. Ингибиторы из первого семейства, связываясь с Cdk4/6, препятствуют присоединению к ним цик-лина D и тем самым предотвращают формирование активных циклин-киназных комплексов [1]. Вторая группа ингибиторов взаимодействует и с циклинами, и с киназами, не препятствуя формированию циклин-киназных комплексов, но подавляет их активность [2]. Функциональные аналоги CKI позвоночных известны у дрожжей Saccharo-myces cerevisiae - p40Sic1 регулирует вхождение в S-фазу, подавляя активность Cdc28p-Clbp [3], а Farlp ингибирует Cdc28p-Clnp и участвует в остановке клеточного цикла в ответ на действие феромонов [4].
СТРОЕНИЕ P21WAF1/CIP1 И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ЦИКЛИН-КИНАЗНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ
Ингибитор циклин-зависимых киназ p2iWafi/Cipi/sdii/CAP20 был идентифицирован в 19931994 гг. как фактор, ингибирующий активность Cdk2 in vivo [5-7], как эффектор p53-индуцирован-ного блока клеточного цикла [8] и как ингибитор репликации ДНК в стареющих клетках (cell senescence) [9]. Индукция p21Waf1/Cip1 вызывает снижение активности комплекса циклин E-Cdk2 и остановку клеточного цикла в фазе G1 [10, 11]. Это небольшой белок молекулярной массой 19-21 кДа, размером около 160 аминокислотных остатков (а.о.):
1 17 24 49 71 152158 164
53-58
Схематическое изображение р21^п/С1р1 человека. Су1, Су2, Сёк и РСКЛ - участки взаимодействия с циклином, ки-назой и РСКЛ соответственно. Цифры указывают порядковый номер аминокислотного остатка. ТИг145 - сайты фос-форилирования.
мышь - 159, кошка - 164, человек - 164 а.о. У млекопитающих этот белок характеризуется высокой консервативностью: так, р21т(1/С1р1 мыши и человека идентичны на 76%. Предсказание вторичной структуры предполагает наличие по крайней мере трех коротких а-спиральных участков в районах 34-46, 65-69 и 151-153 а.о. (для р2^ап/ар1 человека). По-видимому, р21^1/С1р1 в свободном состоянии не имеет выраженной третичной структуры, а С-концевая часть молекулы менее структурирована, нежели ее К-концевой фрагмент. Однако в результате связывания с ки-назой молекулярная структура р21та1/С1р1 становится более упорядоченной [12].
Как было упомянуто выше, р21та1/С1р1, вместе с р27К1р1 и р57К1р2, относится к семейству С1р/К1р ингибиторов циклин-зависимых киназ. Первые два представителя этого семейства синтезируются во всех тканях млекопитающих, тогда как последний проявляет более выраженную тканевую спе-цефичность [13]. Ингибиторы р21^1/С1р1, р27К1р1 и р57К1р2 имеют высокую степень гомологии (3947%) в К-концевой части - домен из ~60 а.о., который содержит участки связывания с циклином (Су) и киназой (К) [2, 14, 15]. Все три белка имеют сигнал ядерной локализации в С-концевой части. Схематическое изображение молекулы р21та1/С1р1 представлено на рисунке.
Циклин-связывающий участок в К-концевой части ингибиторов необходим для взаимодействия как со свободным циклином, так и с циклин-киназным комплексом. Для р21тп/С1р1 человека этот высокоаффинный участок был картирован в районе 17-24 (мутантная форма р21тп/С1р1 с удаленным фрагментом ЛСККЬГОР была неспособна связываться с циклинами А и Е). Эта последовательность консервативна для всех ингибиторов семейства С1Р (семь из восьми а.о. идентичны) [2]. Консенсус-последовательность ЯКЬБ состоит из двух основных и двух следующих за ними неполярных аминокислотных остатков. Участок для связывания с киназой расположен более проксимально - в молекуле р21тп/С1р1 человека он находится во фрагменте 49-71 [16, 17], причем а.о. 5358 играют важнейшую роль в этом взаимодействии. В отличие от р27К1р1 и р57К1р2, р21^1/С1р1 имеет еще один низкоаффинный участок связывания
с циклином (Cy2) в С-концевой части - 152-158. Эта последовательность имеет сходство с Cy1 -HSKRRLIF [2]. Показано, что взаимодействие p21Waf1/Cip1 с циклин A/E-Cdk2 затрагивает все три участка - Cy1, K и Cy2. Циклин D взаимодействует с p21Waf1/Cip1 только в комплексе с Cdk4/6 и, по-видимому, не затрагивает Cy2. Удаление из p21Waf1/Cip1 человека фрагмента 53-58, ответственного за взаимодействие с Cdk, не препятствовало связыванию ингибитора как с циклином, так и с циклин-киназным комплексом, однако значительно снижало ингибирующую способность p21Waf1/Cip1. Для реализации ингибирующей функции p21Waf1/Cip1 необходимы оба циклин-связыва-ющих участка, что было продемонстрировано в опытах in vitro - удаление любого из них при сохранении участка взаимодействия с Cdk2 приводило к значительному снижению ингибирования активности циклин-киназных комплексов. Интересно отметить, что активность циклин-киназных комплексов может частично подавляться и без прямого связывания p21Waf1/Cip1 с Cdk2: короткие пептиды, соответствующие циклин-связыва-ющим фрагментам Cy1 и Cy2, ингибировали ки-назную активность циклин E-Cdk2 и циклин A-Cdk2, хотя и в меньшей степени, чем целый белок [2]. Универсальность p21Waf1/Cip1 в отношении цик-лин-киназных комплексов довольно широка: он эффективно связывается и ингибирует активность Cdk2, Cdk3, Cdk4 и Cdk6, но менее эффективен в отношении Cdc2/циклин B и Cdk5/p35 и не ингибирует комплексы Cdk7/циклин H [18].
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ p21Wafl/cipl С PCNA
До недавнего времени считалось, что только p21Waf1/Cip1, в отличие от других представителей своего семейства, имеет в С-концевой части молекулы участок взаимодействия с PCNA [15, 19]. Область связывания PCNA в p21Waf1/Cip1 человека по одним данным затрагивает фрагмент 142-163, а по другим - 144-151 [17]. Нужно отметить, что в этом районе находятся также сигналы ядерной локализации (140-157) и два сайта расщепления каспазой 3 [20]. Однако недавно появились данные, свидетельствующие о наличии в С-концевой части p57Kip2 участка взаимодействия с PCNA.
Как и у p21Waf1/Cip1, С-концевой домен p57Kip2 in vitro подавляет репликацию ДНК и in vivo приостанавливает вхождение в S-фазу, а удаление участка связывания с PCNA снижает ингибирующую способность p57Kip2 [21]. Известно, что PCNA является фактором процессивности ДНК-полиме-разы 5 и участвует как в репликации, так и в репарации ДНК [22]. Как уже упоминалось, одной из первоначально описанных функций p21Waf1/Cip1 было его взаимодействие и подавление активности PCNA [9]. Связывание p21Waf1/Cip1 с PCNA не влияет на взаимодействие ингибитора с циклин-киназными комплексами. Способность C-конце-вой части p21Waf1/Cip1 взаимодействовать с PCNA и вызывать ингибирование синтеза ДНК независимо от наличия его циклин-Cdk-связывающего домена показана в опытах in vitro [23] и in vivo [19]. Позднее с использованием тетрациклин-регули-руемой системы в клетках, не экспрессирующих p53, показано, что индукция мутантной формы p21Waf1/Cip1, не способной взаимодействовать с Cdk, но сохранявшей интактный участок связывания с PCNA, подавляла синтез ДНК и вызывала остановку клеточного цикла в точках G1 и G2 в такой же степени, как при индукции p21Waf1/Cip1 дикого типа [15]. Однако в других опытах получены данные о том, что N-концевой фрагмент p21Waf1/Cip1, не содержащий участка взаимодействия с PCNA, вызывал тот же эффект, что и полноразмерный белок - подавление активности циклин-киназных комплексов и задержку вхождения в S-фазу [24]. Кроме того, обнаружено, что значительная часть клеточного пула p21Waf1/Cip
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.