БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2003, том 29, № 1, с. 100-102
УДК 577.113.6
ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ МЕЖНУКЛЕОТИДНУЮ ФОСФАМИДНУЮ СВЯЗЬ
© 2003 г. А. Н. Синяков*, А. С. Буторин**, Д. С. Новопашина***, Л. Альби**, В. А. Рябинин*#
* Институт молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор", 630559, пос. Кольцово Новосибирской обл.; **Лаборатория биофизики. Национальный музей естественной истории, Париж, Франция; *** Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск Поступило в редакцию 24.06.2002 г. Принято к печати 24.09.2002 г.
Предложен метод функционализации олигонуклеотидов путем присоединения аминоалкилпроиз-водных по межнуклеотидному атому фосфора Ш'-Р5'-фосфамидной связи олигонуклеотида в присутствии трифенилфосфина, 4-диметиламинопиридина и 2,2'-дипиридилдисульфида. Реакция протекает как с низкомолекулярными алкиламинами (1,6-диаминогексан, ЛОУ-диметил-^З-диаминопро-пан), так и с лигандом малой бороздки, содержащим линкерную аминоалкильную группу.
Ключевые слова: модифицированные олигонуклеотиды; лиганд малой бороздки; фосфамид.
В настоящее время существуют самые разнообразные методы синтеза модифицированных олигонуклеотидов. Эти методы включают введение модифицирующих фрагментов как в процессе синтеза олигонуклеотидов с использованием модифицированных мономеров [1, 2], так и путем постсинтетической обработки олигонуклеотидов (см., например, [3]). Разработанные методики позволяют получать олигонуклеотиды и с модифицированными основаниями, и с модифицированным рибозофосфатным остовом. Один из наиболее распространенных способов введения модифицирующей группы по концевым 3'- и 5'-положениям олигонуклеотида предложен авторами работы [4] и в дальнейшем развитый в работах [5, 6]. Суть его заключается в обработке 3'-или (и) 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов первичными или вторичными алифатическими аминами в присутствии 2,2'-дипиридилдисульфи-да, трифенилфосфина и нуклеофильных катализаторов (уУ-метилимидазол, ОМАР и т.д.), что приводит к образованию олигонуклеотидов с заместителями, присоединенными по концевым фосфатным группам через фосфамидную связь. При этом присоединения лиганда по межнуклеотидному атому фосфора не происходит. Недавно было показано, что в апротонных полярных растворителях (БМ80, ОМР), кроме монофосфами-да, происходит образование и бисфосфамида [7-9]. Это дает основания предполагать, что образо-
Сокращения: БМАР - 4-диметиламинопиридин; (РуЗ)2 -
2,2'-дипиридилдисульфид. # Автор для переписки (тел.: (3832) 30-46-53; эл. почта:
ryabiniii@niboch.nsc.ru).
вание бисфосфамида возможно и при наличии межнуклеотидной фосфамидной связи в олиго-нуклеотиде, что позволит получать олигонуклеотиды с модифицированным фосфатным остовом. Поскольку в этих условиях межнуклеотидная фосфатная группа в реакцию не вступает, то заместитель будет вводиться в состав олигонуклеотида в положение, определяемое местонахождением фосфамидной связи.
Для определения возможности модификации олигонуклеотидов, включающих межнуклеотидную фосфамидную связь (пр), нами был использован оли-годезоксирибонуклеотид (5')ТрТрАрТрТпрТрОрС с №'-Р5'-фосфамидной связью, полученный по методике [10]. В качестве модифицирующих соединений (ЯГЧНз) мы применяли низкомолекулярные алкиламины (1,6-диаминогексан, /УД-диметил-1,3-диаминопропан), а также малобороздочный лиганд (I) [11], содержащий на /У-конце трипир-ролкарбоксамида алифатическую аминогруппу (остаток е-аммнокапроновой кислоты). Выбранный нами лиганд (I) позволяет контролировать присоединение его к олигонуклеотиду как хромато-графически, так и по электронным спектрам. Олигонуклеотид (цетилдиметиламмониевая соль) выдерживали в течение 16 ч при комнатной температуре в ОМИ в присутствии трифенилфосфина, 2,2'-дипиридилдисульфида и 4-диметиламинопиридина и лиганда (I) в соответствии с методикой, приведенной в статье [3], и анализировали денатурирующим гель-электрофорезом (данные не приводятся) и офВЭЖХ (рис. 1).
ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
101
NHR
т л т -г т п п rnh2' (PyS)2, P(Ph.),, DMAP/DMF I
(5 )TpTpApTpTnpTpGpC-=-=---- (5 )TpTpApTpTnpTpGpC
RNH2 =
V CD
Материал первого пика на хроматограмме реакционной смеси не содержит в своем составе олигонуклеотидного фрагмента и при гель-электрофорезе не наблюдается. Второй пик по времени удерживания, электрофоретической подвижности и электронному спектру отвечает исходному олигонуклеотиду. Третий пик соответствует продукту присоединения малобороздочного лиган-да к олигонуклеотиду. Большее время удерживания обусловлено липофильными свойствами конъю-гированного лиганда.
По данным электронной спектроскопии (рис. 2), продукт, отвечающий пику 3 на хроматограмме (рис. 1), действительно является конъюгатом олигонуклеотида и малобороздочного лиганда (I), так как его спектр представляет собой суперпозицию спектров олигонуклеотида и малобороздочного лиганда. Молекулярная масса выделенного конъюгата по данным масс-спектромет-
пШ 1.21-
0.8
0.4
10
15 мин
Рис. 1. Обращенно-фазовая хроматограмма реакционной смеси, получающейся при взаимодействии (5')TpTpApTpTnpTpGpC с лигандом (I). Линейный градиент ацетонитрила (5-40%) в 0.02 М ацетате аммония в течение 30 мин; скорость элюции 2 мл/мин. Хроматограф 1100 Agilent Technologies, колонка Waters С-18 X-Terra, 7.8 х 300 мм, 7 ц.
рии (MALDI-TOF, прибор Voyager de Pro (Perkin-Elmer Biosystems)) равна 2952.62, что соответствует расчетному значению для конъюгата лиганда (I) и модельного олигонуклеотида (2953.30).
Следует отметить, что реакция конъюгирова-ния протекает не очень эффективно и выход продукта составляет 10-20%. Простое увеличение продолжительности выдерживания реакционной смеси приводит лишь к небольшому повышению выхода конъюгата. Использование в аналогичной реакции вместо лиганда (I) низкомолекулярного первичного амина - гексаметилендиамина или Л^-диметил-1,3-диаминопропана - также приводит к его присоединению к атому фосфора межнуклеотидной фосфамидной связи олигонуклеотида (5')TpTpApTpTnpTpGpC. По данным оф-ВЭЖХ и гель-электрофореза, выход целевого продукта в этом случае также невысок и составляем 10-20% (данные не приводятся). Следует подчеркнуть, что наблюдаемые превращения обусловлены наличием фосфамидной связи, так как олигонуклеотид (5')TpTpApTpTpTpGpC, не содержащий фосфамидной связи, в аналогичных условиях не образует конъюгата с лигандом (I).
Предложенный метод функционализации оли-гонуклеотидов позволяет вводить заместитель, содержащий аминоалкильные остатки, по межнуклеотидной фосфатной группе. Место присоединения модифицирующего фрагмента определяется при этом положением фосфамидной связи,
220
270
320
370
Рис. 2. Электронные спектры исходного олигонуклеотида (5')TpTpApTpTnpTpGpC (/), лиганда (I) (2) и их конъюгата (пик 3 на хроматограмме рис. 1) (3).
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 29 № 1
2003
102
СИНЯКОВ и др.
вводимой в олигонуклеотидную последовательность в процессе синтеза. Выход целевого продукта. хотя и не столь высок по сравнению с аналогичной модификацией концевой фосфатной группы (так, присоединение двух остатков мало-бороздочных лигандов протекает с выходом до 50% [7, 8]), вероятно, может быть увеличен за счет подбора условий реакции. Очевидно, что аналогичные превращения будут протекать с олиго-нуклеотидами, содержащими не только N3-P5'-, но и М5'-РЗ'-фосфамидную связь, и предложенный метод может быть полезен для постсинтетического введения самых различных модифицирующих фрагментов в состав рибозофосфатного остова олигонуклеотида.
Работа выполнена при финансовой поддержке INTAS (проект № 01-0638), Министерства иностранных дел Франции (проект EGIDE 04542ND) и Международного проекта "Конъюгаты модифицированных олигонуклеотидов с лигандами малой бороздки, интеркаляторами и ингибиторами топоизомеразы - стабилизация тройной спирали и направленная модификация двуспиральной ДНК" (проект № 04.70043-69). Авторы благодарны Ж.-П. Бруару и J1. Дюбосту за регистрацию масс-спектров MALDI-TOF.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Methods in Molecular Biology: Protocols for Oligonucleotides and Analogs. Synthesis and Properties / Ed. S. Agrawal. Totowa NJ: Humana Press, 1993. P. 143-390.
2. Verma S., Eckstein F. // Annu. Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 99-134.
3. Grimm G.N., Boutorine A.S., Helena C. // Nucleos. Nu-cleot. Nucleic Acids. 2000. V. 19. P. 1943-1965.
4. Hashimoto M., Ueki M., Mukaiyama T. // Chem. Lett. 1976. V. 2. P. 157-160.
5. Годовикова T.C., Зарытова В.Ф., Мальцева Т.В., Халимская JI.M. // Биоорган, химия. 1989. Т. 15. С. 1246-1252.
6. Knorre D.G., Alekseyev P.V., Gerassimova Y.V., Silnik-ov V.N., Maksakova G.A., Godovikova T.S. // Nucleosides Nucleotides. 1998. V. 17. P. 397—410.
7. Рябинин B.A., Денисов А.Ю., Пышный Д.В., Абрамова Т.В., Синяков А.Н., Власов В.В. // Докл. АН. 1999. Т. 368. С. 836-838.
8. Денисов А.Ю., Рябинин В.А., Пышный Д.В., Абрамова Т.В., Синяков А.Н. // Журн. структ. химии. 2001. Т. 42. С. 11-119.
9. Kostenko Е., Dobrikov М., Pyshnyi D., Petyuk V., Кота-rova N.. Vlassov V.. Zenkova M. // Nucl. Acids Res. 2001. V. 29. P. 3611-3620.
10. Baraniak J., Korczynsky D., Kaczmarek R., Wasilews-ka E. // Nucleosides Nucleotides. 1998. V. 17. P. 1347-1353.
11. Рябинин В.А., Синяков А.Н. // Биоорган, химия. 1998. Т. 24. С. 601-607.
Functionalization of the Oligonucleotides Containing an Internucleotide Phosphoramidate Bond
A. N. Sinyakov*, A. S. Boutorine**, D. S. Novopashina***, L. Halby**, and V. A. Ryabinin*#
#Phone: +7 (3832) 30-4653, e-mail: i~yabinin@niboch.nsc.ru * Institute of Molecular Biology, Vector State Research Center of Virology and Biotechnology, pos. Kol'tsovo, Novosibirsk oblast, 630559 Russia **Laboratoire de Biophysique, 1NSERM U565-CNRS UMR 8646, Muséum National d'Histoire Naturelle, 43 rue Cuvier, 75231 Paris Cedex 05, France *** Novosibirsk Institute of Bioorganic Chemistry, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, pr. Akademika
Lavrent' eva 8, Novosibirsk, 630090 Russia
A new method for functionalization of oligonucleotides by addition of aminoalkyl derivatives to the intermolec-ular p
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.