НЕЙРОХИМИЯ, 2015, том 32, № 1, с. 37-47
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.17
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИСТЕМЫ В МОЗГЕ КРЫС С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ, ВЫЗВАННЫМ ИММУНИЗАЦИЕЙ ПЕПТИДОМ 11-25 МЕЛАНОКОРТИНОВОГО РЕЦЕПТОРА 4-ГО ТИПА © 2015 г. А. О. Шпаков1, *, К. В. Деркач1, О. А. Жарова2, Е. А. Шпакова3
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук,
Санкт-Петербург 2Фармацевтическая компания ООО "Тева", Ярославль 3Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук, Санкт-Петербург
Меланокортиновая система мозга, включающая меланокортиновые рецепторы 4-го типа (М4Р), играет ключевую роль в регуляции энергетического гомеостаза, контролирует функции нервной системы. Ингибирование М4Р приводит к ожирению и метаболическому синдрому. Предполагается, что в основе этого лежат изменения, возникающие в нейромедиаторных системах мозга. Для доказательства этого было изучено влияние длительной иммунизации крыс БСА-конъюгатом пептида К-[Т8ЬН1ЖКК38Н0ЬН011-25]-А (К-[11-25]-А), соответствующего внеклеточному М-концевому участку М4Р, на активность гормоночувствительной аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) мозга. У крыс, которых многократно, на протяжении года, иммунизировали БСА-конъ-югатом (группа "И") отмечали повышение массы тела, нарушение толерантности к глюкозе, инсу-линовую резистентность, дислипидемию. Через 13 мес. после начала эксперимента оценивали активность АЦСС в синаптосомальных мембранах, выделенных из мозга крыс. Базальная активность АЦ и ее регуляция ГИДФ и форсколином не отличались от таковых в контроле. В группе "И" снижались стимулирующие АЦ эффекты а-меланоцитстимулирующего гормона (а-МСГ), М4Р-аго-ниста ТН]^, дофамина и гипофизарного АЦ-активирующего полипептида и ослаблялись ингиби-рующие АЦ эффекты серотонина и 5-нонилокситриптамина, агониста серотониновых рецепторов (СР) 1Б/Ш-подтипа. При этом сродство М4Р к агонистам не менялось. Стимулирующий АЦ эффект М3Р-агониста у-МСГ усиливался, что является компенсаторной реакцией на ослабление функций М4Р. Стимулирующие АЦ эффекты серотонина, агониста СР 6-го типа БМВ-386088, релаксина и норадреналина, а также ингибирующие эффекты норадреналина, Б2-агониста бромо-криптина и соматостатина в группе "И" не менялись. Таким образом, ингибирование М4Р вследствие иммунизации БСА-конъюгатом пептида К-[11-25]-А меняет чувствительность АЦСС мозга крыс к пептидам меланокортинового семейства и другим нейрогормонам. Эти изменения характеризуются гормональной и рецепторной специфичностью, и могут быть одной из причин инсулино-вой резистентности, метаболического синдрома и функциональных нарушений в ЦНС и на периферии в условиях М4Р-дефицита.
Ключевые слова: аденилатциклаза, аденилатциклазная сигнальная система, гипофизарный аденилат-циклазу активирующий полипептид, дофамин, мозг, меланокортиновый рецептор, меланоцитстиму-лирующий гормон, метаболический синдром, иммунизация, пептид, серотонин.
DOI: 10.7868/S1027813315010094
ВВЕДЕНИЕ
Меланокортиновая сигнальная система мозга играет ключевую роль в регуляции пищевого поведения и энергетического гомеостаза, вовлечена в
* Адресат для корреспонденции: 194223, Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44, тел. (812) 552-31-17; факс (812)552-30-12; e-mail: alex_shpakov@list.ru.
контроль когнитивных функций, поведения, функциональной активности эндокринной, сердечно-сосудистой и репродуктивной систем [1—5]. Нарушение функционирования меланокортино-вой системы мозга приводит к гиперфагии, ожирению, метаболическому синдрому, снижает синап-тическую пластичность, следствием чего является когнитивный дефицит. Основными звеньями ме-
ланокортиновой системы являются сопряженные с гетеротримерными О-белками стимулирующего типа (О8) меланокортиновые рецепторы 4-го типа (М4Р), активируемые а-меланоцитстимулирую-щим гормоном (а-МСГ) и родственными ему ней-ропептидами (в- и у2-МСГ), продуктами расщепления проопиомеланокортина [7, 8]. Связывание М4Р с агонистами приводит к активации О8-бел-ков и стимуляции фермента аденилатциклазы (АЦ), катализирующего образование вторичного посредника сАМР, и нижележащих сАМР-зави-симых внутриклеточных каскадов. Необходимо отметить, что в мозге также вырабатывается функциональный антагонист М4Р — агути-подобный пептид (АПП), который взаимодействует с внеклеточными участками М4Р. Показано, что АПП снижает присущую М4Р конституционную активность, препятствует связыванию рецептора с М4Р-агонистами и ингибирует активацию ими аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) [8, 9]. Поскольку в мозге меланокортиновая система функционально взаимосвязана с другими сигнальными системами, которые регулируются серотонином, дофамином, норадреналином, нейропептидами, адипокинами, она является важнейшим интегратором всей сигнальной сети мозга, осуществляя через нее контроль широкого спектра физиологических и биохимических процессов в ЦНС и на периферии. Однако в настоящее время влияние длительного ослабления М4Р-зависимых сигнальных путей на функционирование нейромедиаторных систем мозга остается мало изученным, а данные об изменениях в сАМР-зависимых сигнальных каскадах в тканях мозга в
условиях ингибирования М4Р отсутствуют.
Снижение активности меланокортиновой системы мозга может быть вызвано антителами, специфичными к а-МСГ, которые обнаружены в крови человека и грызунов и способны преодолевать гематоэнцефалический барьер [10, 11]. В
Принятые сокращения: АЦ — аденилатциклаза, АЦСС — аденилатциклазная сигнальная система, АПП — агути-подобный пептид, ГИДФ — 5'-гуанилилимидодифосфат, Dj-ДР и В2-ДР — дофаминовые рецепторы 1-го и 2-го типов, ИГТТ — инсулин-глюкозотолерантный тест, ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП — липопротеиды очень низкой, низкой и высокой плотности, М3Р и М4Р — меланокортиновые рецепторы 3-го или 4-го типов, МСГ — меланоцитстимули-рующий гормон, 5-НОТ — 5-нонилокситриптамин, СР — серотониновый рецептор, Gs- и Gj-белки — гетеротример-ные G-белки стимулирующего и ингибирующего типов, EMD-386088 - 5-хл ор-2-метил-3-( 1,2,3,6-тетрагидро-4-пиридинил)-1Н-индол, HOMA-IR — гомеостатическая модель оценки инсулиновой резистентности (homeostasis model assessment — insulin resistance), PACAP-38 — гипофи-зарный АЦ-активирующий полипептид длиной 38 аминокислотных остатков (pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide-38), THIQ — ^-[(1^)-1-[(4-хлорофенил)ме-тил]-2-[4-циклогексил-4-(1Н-1,2,4-триазол-1-илметил)-1-пиперидинил]-2-оксоэтил]-1,2,3,4-тетрагидро-3-изохино-линкарбоксамид.
экспериментах с крысами показано, что их титр в значительной степени повышается при хроническом мягком стрессе, причем они могут как снижать М4Р-зависимые сигнальные каскады, нейтрализуя эндогенный а-МСГ, так и усиливать их, повышая сродство рецептора к а-МСГ, находящемуся в комплексе с антителами [11]. Вследствие этого, антитела к а-МСГ могут оказывать на чувствительную к меланокортину АЦСС мозга разнонаправленные влияния. Функциональная активность М4Р может быть снижена с помощью антител, выработанных на антигенные детерминанты, которые локализованы во внеклеточных петлях М4Р, вовлеченных в специфичное связывание с агонистами [12, 13]. Наибольший интерес здесь представляет N-концевой внеклеточный домен М4Р, который вовлечен в связывание М4Р-агонистов и АПП. Иммунизация крыс полипептидом, соответствующим N-концевому домену М4Р, приводит к повышению потребления пищи, увеличению массы тела, нарушениям липид-ного и углеводного обмена [12].
Цель работы состояла в изучении влияния длительной иммунизации самцов крыс БСА-конъюгированным пептидом K-
[TSLHLWNRSSHGLHG11-25]-A (K-[11-25]-A), который структурно соответствует внеклеточному N-концевому участку М4Р, на функциональную активность АЦСС мозга, чувствительную к биогенным аминам и пептидным гормонам, в том числе к пептидам меланокортинового семейства. Для характеристики функционального состояния иммунизированных крыс исследовали их массу тела, метаболические показатели (уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов, холестерина), толерантность к глюкозе и чувствительность к инсулину. Ранее в условиях in vitro нами было показано, что пептид K-[11-25]-A в микромолярных концентрациях снижает активацию АЦ агонистами М4Р, что свидетельствуют в пользу его способности нарушать связывание агонистов с рецептором [14]. Для повышения иммуногенности пептида, синтезировали его конъюгат с БСА.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для проведения биохимических экспериментов использовали а-МСГ, у-МСГ, серотонин, дофамин, бромокриптин, норадреналин, сомато-статин, гипофизарный АЦ-активирующий поли-пептид-38 (PACAP-38), релаксин-2, форсколин, 5'-гуанилилимидодифосфат (ГИДФ), креатин-фосфат, креатинфосфокиназу из мышц кролика, ATP, cAMP, полученные из фирмы Sigma-Aldrich (США), а также ^-[(1Д)-1-[(4-хлорофенил)метил]-
2-[4-циклогексил-4-(Ш-1,2,4-триазол-1-илметил)-1-пиперидинил]-2-оксоэтил]-1,2,3,4-тетрагидро-
3-изохинолинкарбоксамид (THIQ), 5-нонилок-
ситриптамин (5-НОТ) и 5-хлор-2-метил-3-(1,2,3,6-тетрагидро-4-пиридинил)-Ш-индол (EMD-386088), полученные из фирмы Tocris Cookson Ltd. (Великобритания). Для определения активности АЦ использовали [a-32P]ATP (1000 Ки/ммоль) (ОАО Всерегиональное объединение "Изотоп", Россия).
Пептид K-[TSLHLWNRSSHGLHG11-25]-A-амид (K-[11-25]-A), соответствующий по первичной структуре внеклеточному N-концевому участку М4Р крысы, синтезировали с помощью твердофазного синтеза на пара-метилбензгидриламин-ной смоле (емкость 1.16 ммоль/г) с использованием аминокислот, защищенных ^а-трет-бутилокси-карбонильными группами. Образование пептидной связи проводили с использованием метода активированных эфиров, получая 1-оксибензотриа-золиловые эфиры аминокислот с помощью ^.^-диизопропилкарбодиимида. Для деблокирования функциональных групп аминокислот и снятия пептида с полимерного носителя использовали смесь трифторметансульфокислоты (1 мл) и трифторуксусной кислоты (10 мл) в присутствии тиоанизола (1 мл) и этандитиола (0.5 мл) (все количеств
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.