ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 414, № 1, с. 126-129
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 57.536:571.27
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ НЕЙТРОФИЛОПОДОБНЫХ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ В ИММУННОМ ОТВЕТЕ НА КЛЕТКИ АЛЛОГЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ
© 2007 г. Е. В. Маршхнич, Е. С. Звездова, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, Д. Б. Казанский
Представлено академиком Г.И. Абелевым 08.11.2006 г. Поступило 13.11.2006 г.
В иммунном ответе на клетки аллогенных опухолей первичное распознавание молекул MHC класса I Т-лимфоцитами CD8+ может определять последующее развитие реакций врожденного иммунитета, необходимых для пролиферации и дифференцировки цитотоксических Т-лимфоци-тов CD8+ (CTL). Ранее мы показали, что в первичном ответе на иммунизацию клетками аллогенных опухолей в селезенке мышей накапливаются клетки, имеющие морфологию сегментоядерных нейтрофилов. Однако детальное исследование фенотипа этих клеток выявило как черты сходства, так и особенности, отличающие их от нейтрофилов, циркулирующих в периферической крови. Подобно обычным нейтрофилам, выявленная популяция клеток экспрессирует миелоидный маркёр Gr-1 (Ly6G) и общий маркёр гранулоцитов и макрофагов CD11b (Mac-1). Большая часть этих клеток лишена маркёра CD31, что характерно для активированных нейтрофилов. В отличие от обычных нейтрофилов эти клетки экспрессиру-ют костимулятор B7-1 (CD80) и молекулы MHC класса II, что придает им черты профессиональных антигенпрезентирующих клеток (АПК) и позволяет их описать как особую субпопуляцию нейтрофилов. Интенсивность накопления этих клеток зависит от Т-лимфоцитов CD8+, так как у генетических нокаутов по молекулам TAP, Р2-микроглобулина и CD8 она снижена, тогда как у нокаутов по корецептору CD4 не снижена [1]. Механизм индукции и функциональная роль этих клеток в развитии реакций адаптивного иммунитета оставались до сих пор неясными. В этой работе мы представляем данные об участии Т-кле-ток CD8+ в мобилизации нейтрофилоподобных клеток. Показываем, что такие нейтрофилопо-
ГУ Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина
Российской Академии медицинских наук, Москва
добные клетки играют роль в развитии CTL и эта роль может быть опосредована экспрессией IL-12, вызванной иммунизацией клетками аллогенных опухолей.
В работе использованы мыши C57BL/6 (KbIbDb) разведения вивария ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Мастоцитому P815 (KdDd) и ее вариант P815-GFP, стабильно трансфецированный модифицированным геном зеленого флуоресцентного белка вектора pEGFP-N1 [2], переклонированным в ретровирусный вектор pMSCVpuro [3], поддерживали культивированием in vitro в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в диапазоне клеточных концентраций (0.1-1) ■ 106/мл. Мышей иммунизировали опухолевыми клетками внутрибрюшинно в дозе 2 ■ 107. Спленоциты иммунных животных выделяли на четвертый день после иммунизации, фракционировали методом иммуномагнитной сепарации и в течение трех дней инкубировали в полной среде RPMI-1640 c добавлением 5% сыворотки человека, 4 ммоль L-глутамина ("Пан Эко", Россия), 1% 2M раствора HEPES ("GIBCO") и 5 ■ 10-5 М 2-мер-каптоэтанола ("Merck") при 37°С в атмосфере с 5%-ным CO2 и абсолютной влажностью. Для определения активности CTL анализируемые образцы лимфоидных клеток инкубировали в течение 4 ч с клетками P815-GFP, окрашивали иодистым пропи-дием и долю оставшихся жизнеспособными "зеленых" клеток определяли с помощью проточной цитофлуориметрии, цитотоксический индекс подсчитывали по ее снижению по отношению к контрольным образцам, не содержащим эффектор-ных CTL [4]. Антитела к молекуле CD8a (асцит, полученный введением клеток гибридомы 53-6.7 мышам nude) вводили мышам по 0.5 мл за сутки до иммунизации однократно в орбитальный венозный синус в виде асцита, разведенного PBS в соотношении 1 : 5.
В работе использованы флуоресцентно меченные антитела фирмы "Pharmingen" (USA). В качестве источника антител к миелоидному маркёру
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ НЕЙТРОФИЛОПОДОЬНЫХ КЛЕТОК 127
Рис. 1. Цитофлуориметрический анализ спленоцитов мышей C57BL/6 интактных (K, без штриховки) и получивших внутривенную инъекцию антител к CD8 (О, серая штриховка) на 6-й день после иммунизации клетками мастоцитомы P-815-GFP. Над маркёрами показано процентное содержание клеток. По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции, по оси ординат - нормализованное число событий.
Gr-1 иcпoльзoвaли cyпepнaтaнт гибридомы RB6-8C5 (любeзнo пpeдocтaвлeнa C.A. Heдocпacoвым, NCI "Frederick", USA). Aнтитeлa к иммyнoглoбy-линам мыши, меченные FITC, и вторичные антитела к Fc-фрагменту иммyнoглoбyлинoв мыши, меченные FlTC, пpиoбpeтeны y фирмы "Sigma" (USA). Peзyльтaты aнaлизиpoвaли, иcпoльзyя пpoгpaммy WinMDI 2.8.
Экспрессию мPHK IL-12 выявляли мeтoдoм RT-PCR в oбpaзцax мPHK, выделенных из cплeнo-цитов интактных и иммунных живoтныx. Для этого выделенные клетки фpaкциoниpoвaли мeтoдoм иммyнoмaгнитнoй сепарации антителами к Gr-1 и мPHK выделяли с иcпoльзoвaниeм реактива TRI REAGENT ("Sigma", St. Louis, MO). Для синтеза ^HK для кaждoй пpoбы брали 1 мкг мPHK, 0.2 мкг праймера random hexamer ("Cинтoл"), дoвoдили смесь пo oбъeмy дo 11 мкл и инкyбиpoвaли 5 мин при 70oC. Затем oxлaждaли на льду и дoбaвляли следующие реагенты: 4 мкл 5x peaкциoннoгo буфера (Invitrogen), смесь четырех dNTP ("Fermentas") дo кoнeчнoй ^нцентрации 1 мМ, 20 единиц ингибитора PHKaз ("Fermentas") и дoвoдили пo oбъeмy дo 19 мкл дeиoнизoвaннoй вoдoй. Затем инкyбиpoвaли смесь 5 мин при кoмнaтнoй температуре. Дoбaвляли в peaкциoннyю смесь 200 единиц oбpaтнoй транскриптазы (Rever-tAidTM M-MuLV, "Fermentas"), инкyбиpoвaли 10 мин при кoмнaтнoй температуре и затем 60 мин при 42oC. Peaкцию синтеза кДHK ocтaнaвли-вали инкyбиpoвaниeм смеси при 70oC в течение 10 мин, пocлe этoгo смесь oxлaждaли на льду. ^лу-ченный pacтвop кДHK дoвoдили дo 60 мкл дeиoни-зoвaннoй вoдoй, и aликвoты зaмopaживaли в o^ дельных пpoбиpкax пo 10 мкл. Peaкцию PCR пpoвo-дили с праймерами: 1) IL-12 р40 (пpямoй, 5'-CAGAAGCTAACCATCTCCTGGTTTG-З'; o6pa^ ный, 5'-TCCGGAGTAATTTGGTGCTTCACAC - З'), размер пpoдyктa З96 bp ; 2) IL-12 рЗ5 (пpямoй, 5'-
AAATGAAGCTCTGCATCCTGC-3'; обратный, 5'-TCACCCTGTTGATGGTCACG-3'), размер продукта 197 bp; 3) GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат де-гидрогеназа, для контроля количества кДНК) (прямой, 5-ACCACCATGGAGAAGGCTGG-3'; обратный, 5-CTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3), размер продукта 528 bp. Для праймеров № 1, 3 первые 4 цикла 94°С - 20 с, 62°С - 30 с, 72°С -35 с; далее 8 циклов таких же, но температура отжига 60°С; далее 25 циклов с температурой отжига 58°С, окончание амплификации - 72°С, 2 мин. Для праймера № 2 18 циклов: 60°С - 2 мин, 72°С -2 мин, 95°С - 1 мин; далее 16 циклов 95°С - 1 мин, 60°С - 2 мин, 72°С - 4 мин; окончание программы: 60°С - 2 мин, 72°С - 10 мин. Затем амплифициро-ванный продукт смешивали с лидирующим красителем, наносили на 1.5%-ный гель агарозы, содержащий бромистый этидий для визуализации ДНК, и разделяли электрофорезом в трис-ацетатном буфере (ТАЕ) при 10 В/см в течение 30 мин. Гели фотографировали с помощью УФ-трансиллюминатора и CD-камеры с программным обеспечением Fly-Video.
Для того чтобы получить прямое подтверждение роли Т-клеток CD8+ как индукторов накопления нейтрофилов в селезенке реципиентов, мышам линии C57BL/6 перед иммунизацией клетками P815-GFP вводили литические антитела к корецепторам CD8 и CD4 (контроль). На 6-й день после иммунизации у экспериментальных животных выделяли спленоциты и анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Как видно на рис. 1, введение антител к корецептору CD8 приводит к исчезновению Т-клеток CD8+ из селезенки реципиента. Это исчезновение сопровождается уменьшением числа нейтрофилоподобных клеток Gr-1+ и увеличением в селезенке доли опухолевых клеток, экспрессирующих GFP, по сравнению со спленоцитами иммунизированных жи-
ДOKЛAДЫ AKAAEMàà HAyK том 414 № 1 2007
128
МАРЮХНИЧ и др.
Цитотоксичность, %
40 г
30 -
20 -
5:1 10:1 20:1
Соотношение эффекторов и мишеней
Рис. 2. Цитолитическая активность спленоцитов иммунизированных мышей C57BL/6, выделенных на 4-й день после иммунизации и инкубированных в течение 3 дней in vitro в присутствии (треугольники) и в отсутствие (кружки) клеток Gr-1+.
вотных, не получавших инъекции антител. Удаление Т-клеток CD4+ введением антител к CD4 в контрольной группе животных таких эффектов не вызывало (данные не представлены). Эти результаты указывают на существование немедленной эффекторной функции Т-клеток CD8+, противодействующей диссеминации трансплантированных клеток аллогенной опухоли в организме реципиента, а также на их прямую роль в накоплении нейтрофилоподобных клеток Gr-1+ в селезенке опухоленосителей.
Для оценки влияния нейтрофилоподобных клеток Gr-1+ на образование CTL мы использовали систему индукции иммунного ответа в течение 4 дней in vivo с последующей инкубацией спленоцитов иммунизированных животных в течение 3 дней in vitro. Перед помещением клеток в культуру in vitro из клеточной суспензии устраняли клетки Gr-1+ методом иммуномагнитной сепарации. После инкубации в полной среде в течение 3 дней жизнеспособные клетки выделяли из культуры и определяли их цитолитическую активность. На рис. 2 видно, что устранение клеток Gr-1+ из общей популяции спленоцитов иммунизированных животных приводит к заметному снижению цито-литической активности по сравнению с образцами клеток, содержащими клетки Gr-1+. Аналогичный результат был нами получен in vivo при внутривенном введении антител к Gr-1 с тестированием цитотоксичности на 12-й день после иммунизации (данные не представлены). Снижение цитолитиче-ской активности сопровождается общим усилением пролиферации в культурах спленоцитов, лишенных клеток Gr-1+ (рис. 3). При этом анализ пролифери-рующих клеток методом проточной цитофлуори-
CPM 35 ■ 103
30 ■ 103
25 ■ 103
20 ■ 103
15 ■ 103
10 ■ 103
5 ■ 103
0
Интактные
Иммунные
Рис. 3. Пролиферация спленоцитов интактных и иммунных мышей C57BL/6, выделенных на 4-й день после иммунизации и инкубированных в течение 3 дней in vitro в присутствии клеток Gr-1+ (черные столбики) и в их отсутствие (незаштрихованные).
метрии не выявил существен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.