БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2015, № 2, с. 91-98
УДК 504.37.054:597-1.111.2
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЕМОГЛОБИНА В АДАПТАЦИИ РЫБ К НИЗКИМ ЗНАЧЕНИЯМ pН СРЕДЫ
© 2015 г. Р. А. Запруднова, И. М. Камшилов, |Ю. П. Чалов
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, е-таП: rimma@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 20.08.2013 г.
Изучена связь устойчивости рыб к закислению среды с функциональными свойствами гемоглобина на представителях 21 вида из 9 семейств, относящихся к пресноводным, морским и проходным. Впервые выявлена прямая зависимость между устойчивостью рыб к низким рН среды и величиной эффекта Бора. На основании проведенных исследований эффект Бора предложен в качестве характеристики буферных свойств гемоглобина и кислотоустойчивости рыб. У самых неустойчивых к закислению среды рыб (осетровых) кривые кислородного равновесия гемоглобина инвариантны. Максимальные нарушения инвариантности в кислом буферном растворе отмечены у наиболее кислотоустойчивых рыб: щуки, окуня. Эффективность гемоглобиновой буферной системы снижалась с понижением устойчивости рыб к закислению водной среды.
Ключевые слова: рыбы, буферная система гемоглобина, эффект Бора, сродство гемоглобина к кислороду, устойчивость к закислению воды.
БО1: 10.7868/80320965215020151
ВВЕДЕНИЕ
В связи с тенденцией к закислению воды в основном под влиянием антропогенных факторов большое значение имеет определение кислотоустойчивости рыб и механизмов их адаптации к изменениям кислотности водоемов. Механизмы адаптации рыб к закислению воды изучены на уровне ионообменных, буферных процессов в жабрах [5, 16, 31, 32, 34, 41]. В стороне от исследователей осталась гемоглобиновая буферная система, на долю которой приходится до 70—75% буферной емкости крови [3, 8].
Цель работы — изучение сродства гемоглобина к кислороду и эффекта Бора у рыб с разной устойчивостью к закислению воды, по которым судили о буферной системе гемоглобина.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов использовали различных по экологии рыб, относящихся к 21 виду, 9 семействам и 9 отрядам.
Пресноводные костистые рыбы. Карась серебряный Carassius auratus gibelio (Bloch), линь Tinca tinca L., сазан Cyprinus carpió L., плотва Rutilus ruti-lus L., лещ Abramis brama L., язь Leuciscus idus L., густера Blicca bjoerkna L., чехонь Pelecus cultratus L. — сем. карповые Cyprinidae; налим Lota lota L. — сем. налимовые Lotidae; окунь Perca fluviatilis L. —
сем. окуневые Percidae; радужная форель Salmo gairdneri irideus Gibb. — сем. лососевые Salmoni-dae; щука Esox lucius L. — сем. щуковые Esocidae; европейский сом Silurus glanis L. — сем. сомовые Siluridae.
Морские костистые. Полярная камбала Li-opsetta glacialis (Pallas) — сем. камбаловые Pleu-ronectidae; зубатка полосатая Anarhichas lupus L. — сем. зубатковые Anarhichadidae.
Пресноводные и проходные хрящекостные рыбы. Проходные: русский осетр Acipenser gueldens-taedtii Brandt, севрюга A. stellatus Pallas, белуга Huso huso (L.); пресноводные: стерлядь A. ruthenus L., сибирский осетр A. baerii Brandt, большой амуда-рьинский лопатонос Pseudoscaphirhynchus kauf-manni (Bogdanow) — сем. осетровые Acipenseridae.
Пресноводные костистые рыбы, за исключением форели, отобранной с Конаковского живорыбного завода, отловлены в бассейне р. Волги; морские костистые рыбы — в Белом море вблизи о. Малый Медведок. Осетровые рыбы, кроме лопатоноса (р. Амударья) и сибирского осетра (Се-ленгинский экспериментальный рыбоводный завод), пойманы в нижнем бьефе Волгоградского гидроузла р. Волги. В работе использовали половозрелых особей. Кровь отбирали сразу после отлова рыб способом каудотомии хвостового стебля, затем собирали в пробирку, стенки которой смачивали гепарином. Полученные пробы цен-
мм рт. ст.
300
200
100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Рис. 1. Величина полунасыщения гемоглобина кислородом (мм рт. ст.) у разных видов рыб: 1 — щука, 2 — окунь, 3 — полярная камбала, 4 — язь, 5 — форель, 6 — зубатка, 7 — плотва, 8 — налим, 9 — чехонь, 10 — лещ, 11 — густера, 12 — сибирский осетр, 13 — карась, 14 — лопатонос, 15 — русский осетр, 16 — белуга, 17 — севрюга,18 — стерлядь, 19 — линь, 20 — сазан, 21 — сом.
трифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин. Плазму удаляли, эритроциты трижды отмывали охлажденным физиологическим раствором (4-10-кратный объем). Отмытые эритроциты лизировали дистиллированной водой. Строму эритроцитов осаждали центрифугированием при 10000-15000 об./мин и температуре 4°С в течение 30 мин.
Величина рН в водоемах обитания рыб колебалась в диапазоне 7.5-8.2.
Кривые кислородного равновесия гемоглобина регистрировали спектрофотометрически при дезоксигенации инертным газом азотом или гелием уравновешенного с воздухом раствора гемоглобина в 50 мМ калий-фосфатном буфере с рН 6.6, 7.2 и 5 при длине волны 430 нм. Характеристическое давление полунасыщения гемоглобина кислородом (Р50, мм рт. ст.) определяли графически на кривых кислородного равновесия гемоглобина. Величину эффекта Бора, представляющую собой снижение сродства гемоглобина к кислороду при закислении среды или обратное
отношение между рН и Р50, также определяли графически для 50%-ного насыщения гемоглобина кислородом в соответствии с уравнением Дилла: А 1§Р50/А рН. [9]. Подробная методика анализа функциональных свойств гемоглобина описана ранее [10]. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (р < 0.05). В работе приведены данные по кислотоустойчивости исследуемых видов рыб, определяемые по токсикологической характеристике РС50, характеризующей концентрацию загрязняющих веществ, вызывающих 50%-ную гибель организмов за 24, 48 или 96 ч [24].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Среди исследуемых рыб минимальное сродство гемоглобина к кислороду в кислом буферном растворе (рН 6.6) обнаружено у щуки (Р50 = = 339.5 мм рт. ст.) (рис. 1). У окуня и полярной камбалы этот показатель выше в 1.5 и 2.2 раза соответственно, максимальное сродство у сома и сазана выше, чем у щуки в 26.5 и 19.0 раз соответ-
%
60
120
мм рт. ст.
Рис. 2. Сродство гемоглобина к кислороду (%) в 50 мМ калий-фосфатном буфере у некоторых видов рыб: 1 — окунь, 2 — щука, 3 — русский осетр, 4 — лещ; рН: 5 — 7.2, 6 — 6.6.
ственно. У представителей осетровых, а также линя и карася сродство гемоглобина к кислороду выше в 6—11 раз. У остальных 8 видов рыб оно занимает промежуточное положение и отличается от сродства гемоглобина щуки в 3.5—5.0 раз. На рис. 2 на представителях трех видов рыб отражено фактически все разнообразие кривых кислородного равновесия гемоглобина. У осетровых кривые кислородного равновесия имеют выраженную 8-образную форму (при рН как 7.2, так и 6.6) и могут быть трансформированы друг в друга с помощью коэффициента (для русского осетра 0.51), т.е. инвариантны. У костистых рыб наблюдается изменение формы кривой кислородного равновесия гемоглобина, при этом наиболее сильное при рН 6.6 у щуки и окуня: кривая теряет верхний изгиб, превращаясь фактически в прямую. У большинства костистых рыб в кислом буферном растворе не происходит полного насыщения гемоглобина кислородом. Самые большие изменения кривых кислородного равновесия в
кислом буферном растворе регистрировали у рыб с наименьшим сродством гемоглобина к кислороду. У щуки в 50 мМ буфере насыщалось кислородом только 27.9% гемоглобина, у окуня — 35.1%. Среди исследуемых рыб наименьшие изменения отмечены у леща, чехони и густеры (6—1%). В 5 мМ буфере неполную оксигенацию гемоглобина наблюдали только у щуки: 27.8% оставались ненасыщенными кислородом.
Величина эффекта Бора гемоглобина у исследуемых рыб в 50 мМ буфере представлена в порядке убывания на рис. 3. Наибольшие значения этого показателя у щуки и окуня, наименьшие — у осетровых рыб. Стерлядь по эффекту Бора достоверно отличается от большинства исследованных осетровых рыб. Ближе всех к осетровым оказалась форель, которая по исследуемому показателю достоверно не отличается от стерляди. Карповые рыбы занимают промежуточное положение между перечисленными видами. Однако среди карповых диапазон колебаний величины эффек-
1.8
1.2
0.6
гЬ
rf
I
rfl
rf
HZi 1
— 3 4
Ph rii rii
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Рис. 3. Эффект Бора и устойчивость к закислению воды у разных видов рыб: 1 — щука, 2 — окунь, 3 — линь, 4 — плотва, 5 — сазан, 6 — карась, 7 — налим, 8 — язь, 9 — полярная камбала, 10 — лещ, 11 — густера, 12 — чехонь, 13 — зубатка, 14 — сом, 15 — форель, 16 — стерлядь, 17 — русский осетр, 18 — севрюга, 19 — сибирский осетр, 20 — белуга, 21 — лопатонос; 1 — величина эффекта Бора, 2 — рыбы с неизвестной (по LC50) устойчивостью к закислению воды, 3 — нижний предел безопасного уровня pH воды для рыб с известной устойчивостью к закислению (по работам [1, 4, 5, 13, 14, 16—18, 20, 22, 25—27, 30, 33, 35, 39, 42]), 4 — нет данных; по оси ординат слева — величина эффекта Бора, справа — pH воды.
0
0
та Бора достаточно широк. Наиболее высоки значения этого показателя у линя и плотвы, несколько ниже (но достоверно не отличаются) у сазана и карася. Самые низкие (достоверно отличаются от других представителей карповых) — у чехони, густеры и леща. Промежуточное положение по величине эффекта Бора среди карповых занимает язь, который достоверно отличается от леща и недостоверно — от карася и сазана. Одинаковые значения исследуемого показателя с язем имеет налим. Полярная камбала по величине эффекта Бора расположена между язем и лещом, достоверно от них не отличаясь; зубатка — между сомом и чехонью, достоверно отличаясь от первого и недостоверно — от последней. Среди костистых по величине эффекта Бора ближе всего к форели находится сом, однако различия между этими видами рыб достоверно значимы.
В 5 мМ буфере характер изменения величины эффекта Бора аналогичен таковому в 50 мМ: максимальные значения исследуемого показателя имели место у щуки и окуня (диапазон изменения 1.4—1.58), минимальные — у осетровых (0.27— 0.40). Остальные виды рыб по величине эффекта Бора занимают промежуточное п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.