ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 415, № 5, с. 703-707
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.21+595.773.4
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ LCR
ИЗ ЛОКУСА cut ДРОЗОФИЛЫ
© 2007 г. Н. А. Чуриков, Д. В. Сосин, О. В. Кретова, Е. Д. Моисеева
Представлено академиком Г.П. Георгиевым 16.03.2007 г. Поступило 16.03.2007 г.
В последние годы появились убедительные свидетельства того, что в хромосомах эукариот имеются протяженные области, в которых транскрипция генов регулируется координированно, т.е. экспрессия расположенных в них генов либо включена, либо выключена. Такие области хромосом называют транскрипционными территориями [1]. Они были выявлены с помощью техники микроэррей. Ранее с помощью фракционирования больших фрагментов ДНК в хромосомах эукариот были обнаружены форум-домены, области длиной 50-150 kb, которые являются единицами сайленсинга или активной транскрипции [24]. На границах форум-доменов расположены так называемые PRE/TRE-последовательности, с которыми связываются белковые комплексы, обеспечивающие репрессию транскрипции (хромосомный сайленсинг) или ее активацию. Эти данные были позже подтверждены при изучении паттерна PRE-последовательностей в геноме дрозофилы, при котором обнаружены домены длиной 50-150 kb - PcG-домены [5]. По всей видимости, транскрипционные территории и являются форум-доменами или PcG-доменами. Однако до сих пор не охарактеризованы свойства последовательностей, позволяющих одновременно включать или выключать транскрипцию на больших расстояниях от границ форум-доменов.
Ранее нами был выявлен сайленсер в LCR (ло-кусконтролирующий район) в локусе cut дрозофилы [6-9]. В настоящей работе мы приводим результаты дальнейшего изучения короткого фрагмента ДНК, содержащего сайленсер, которые убедительно свидетельствуют о том, что в присутствии активного энхансера тот же 268-нуклео-тидный фрагмент проявляет свойства сильного дистантно действующего активатора транскрипции. Следовательно, внутри коротких фрагментов ДНК, расположенных на границах форум-до-
менов, могут располагаться последовательности, вовлеченные как в репрессию, так и в активацию транскрипции. Таким образом, эти фрагменты бивалентны, т.е. имеют двойственные свойства -дистантно действующих сайленсеров или активаторов транскрипции. Впервые получены данные о том, что энхансеры могут переключать PRE/TRE-элементы, которые при этом из сайленсеров превращаются в активаторы транскрипции.
На рис. 1 представлена генетическая конструкция, содержащая репортерный ген люцифе-разы светлячка, находящегося под контролем промотора hsp70 дрозофилы и содержащего область 3'-концевого созревания РНК из гена актина 5С дрозофилы. Данный вектор (p-hsp-GL-3-3'-act) был создан ранее для поиска и анализа регу-ляторных ДНК дрозофилы [10]. В FseI-сайт данного вектора на расстоянии 3.34 kb выше промотора вставляли фрагмент Sau, содержащий сайленсер [8, 9]. Фрагмент нарабатывали с помощью PCR, используя олигонуклеотиды, содержащие искусственные сайты FseI: 5'-cccggccggccGATCGAT-GAGCTTGCCGCCTG-3' и 5'-cccggccggccGATCT-CAATCTCGAATATTTAAAGATA-3'. В некоторые генетические конструкции, на расстоянии 2.841 kb выше промотора, вставляли энхансер из мобиль-
Sau10 Enh (copia) gypsy
У У У
FseI BamHI Kpnl 3'act-5C
hsp luc Fire fly
^YYYY
Рис. 1. Базовый вектор, использованный для создания генетических конструкций [10]. В качестве репор-терного гена выбран ген люциферазы светлячка (luc Fire fly), находящийся под промотором hsp70 (hsp) и содержащий З'-трейлер с сигналами 3'-концевого созревания из гена актина 5C дрозофилы (3'act-5C). Указаны места, использованные для инсерций Sau, энхансера LTR-содержащего элемента copia (enh) и инсулятора gypsy. Указана нумерация по исходному вектору p-GL-3-enhancer (Promega, AC U47297).
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской Академии наук, Москва
704 ЧУРИКОВ и др.
hsp luc Fire fly 3'act-5C
e-• ^
1 h
hsp luc Fire fly 3'act-5C
с
e-h
enh
2
С
Sau
hsp luc Fire fly 3'act-5C
3
S-h
3
С
Sau
41^
enh
hsp luc Fire fly 3'act-5C
3
S-e-h
4
с
Sau —*-
hsp luc Fire fly 3'act-5C
3
S-e-h
enh
5
gypsy
hsp luc Fire fly 3'act-5C
"Г"
e-g-h
enh
6
gypsy
Sau enh hsp luc Fire fly 3'act-5C
Г^--^ ^ S-e-g-h
7
gypsy
Sau Sau enh Я hsp luc Fire fly 3'act-5C
*-N — ,
S-S-e-g-h
9
enh hsp luc Reinilla 3'act-5C
10
_ ^ p-enh-hsp-Renilla-3'act-5C
Рис. 2. Генетические конструкции, использованные в экспериментах по ко-трансфекции. Схематически, не в масштабе, показаны вставки Sau в двух ориентациях, энхансера элемента copia (enh) и инсулятора gypsy в прямой ориентации. Сокращенное название конструкций, приведенное справа, основано на последовательности элементов в ней. Обозначения: S - Sau; e - enh(copia); g - инсулятор gypsy; h - промотор hsp70. Ориентация Sau показана стрелкой. Правильность генетических конструкций подтверждена секвенированием.
ного элемента copia, который активен в культу-ральных клетках дрозофилы - enh(copia) [11]. В ряде конструкций в KpnI-сайт вставляли инсулятор gypsy, наработанный с помощью прайме-ров, содержащих искусственные сайты KpnI: 5'-
cccggtaccTGGCCACGTAATAAGTGTGCG-3' и 5'-cccggtaccGTTGTTGGTTGGCACACCACAA-3'.
Все генетические конструкции, использованные в данной работе, приведены на рис. 2. Дизайн конструкций позволил выяснить, как повлияет
сайленсер локуса cut (Sau) на энхансер и сможет ли в этом случае инсулятор gypsy защитить промотор от влияния сайленсера.
Полученные конструкции использовали для экспериментов по трансфекции клеток Schneider 2 совместно с контрольной конструкцией, содержащей ген люциферазы коралла (Renilla), обрамленный теми же промотором и областью 3'-act-5C (рис. 2, конструкция 10) [10]. Контрольная конструкция использовалась для нормализации данных свечения люциферазы светлячка, т.е. служила для выравнивания эффективности трансфекции в разных экспериментальных точках [10]. Клетки Schneider 2 рассевали накануне до плотности 2 млн/мл - по 1 мл/лунка в планшете на 24 лунки (Nunc). Липосомы, содержащие ДНК конструкций, готовили с помощью реагента TransFast ("Promega") в среде без сыворотки. Клетки осаждали центрифугированием 2000 об/мин в центрифуге MiniSpin ("Eppendorf") в течение 5 мин. К осадку клеток добавляли липосомы (50 мкл) и инкубировали их в пробирках Eppendorf -1.5 мл 1 ч при 27°C. Затем переносили клетки в лунки с полной средой (500 мкл) и инкубировали их 48 ч. После этого клетки суспендировали, осаждали центрифугированием 5 мин - 3000 об/мин, проводили лизис и измерение люминесценции по протоколу Promega (Dual-Glo Luciferase Assay System) на люминометре Reporter (Microplate Turner BioSystems).
На рис. 3 приведены результаты экспериментов. Видно, что введение энхансера приводит к значительному усилению экспрессии репортер-ного гена. Сайленсер же Sau, напротив, заметно ее подавляет. Эти результаты согласуются с данными наших более ранних исследований [8]. Неожиданно для нас добавление сайленсера в обеих ориентациях в конструкции, содержащие энхан-
сер (S -e-h и S -e-h), привело не к подавлению активности гена, а к заметному ее усилению независимо от полярности сайленсера.
Видно также (рис. 3), что введение инсулятора gypsy между энхансером и промотором в несколько раз ослабляет влияние энхансера (ср. экспрессию конструкций e-h и e-g-h). Три последние конструкции, указанные на рис. 3, содержат фрагмент Sau, энхансер и инсулятор. Видно, что фрагмент Sau усиливает экспрессию гена luc (ср. данные экспрессии конструкций e-g-h, S -e-g-h и S -e-g-h), причем Sau в обратной ориентации оказывает более сильный эффект. Таким образом, Sau-активатор обладает полярностью действия. Инсулятор gypsy препятствует прохождению сигнала от Sau-активатора и энхансера к промотору, когда Sau находится в прямой ориентации. Когда же Sau находится в обратной ориентации, тот же сигнал актива-
FLU 1200000 т
1000000
800000
600000
400000
200000
h e-h S-e-h e-g-h S-e-g-h
S-h S-e-h S-e-g-h S-S-e-g-h
Рис. 3. Результаты экспериментов по ко-трансфек-ции. Использовали примерно по 10 нг ДНК конструкций, не обработанных рестриктазами, на одну транс-фекцию. Данные обрабатывали с помощью программ "Excel" и "Origin". Обозначения конструкций, как на рис. 2. Приведены результаты одного из трех экспериментов. В каждом эксперименте было по три параллели (n = 3). Нормализацию по эффективности трансфекции вели по свечению Renilla. Нормализацию данных по количеству ДНК проводили с помощью блот-гибридизации. Для этого смесь использованных для ко-трансфекции растворов ДНК конструкций и стандартного раствора вектора pUC12 (к 8 мкл раствора pUC12, содержащего 10 нг ДНК, добавляли 2 мкл рабочего раствора, содержащего около 10 нг ДНК генетических конструкций) переваривали ферментом BamHI, фракционировали, блотти-ровали, гибридизовали с 32Р-пробой pUC12 и проводили количественный анализ с помощью фос-фоимиджера. В приведенном масштабе примерно пятикратное снижение экспрессии гена luc в конструкции S-h по сравнению с экспрессией конструкции h не так заметно.
ции достигает промотора, не встречая инсулятора. Интересно, что две копии Sau, вставленные в прямой ориентации, значительно усиливают экспрессию (ср. результаты для конструкций S -e-g-h
и S - S -e-g-h). Полярность действия Sau-активато-ра следует также из данных сравнения экспрессии двух последних конструкций на рис. 3: две копии
Sau в конструкции S - S -e-g-h обеспечивают примерно такой же уровень экспрессии, как и одна его копия в конструкции S -e-g-h.
Таким образом, результаты этих экспериментов позволяют сделать вывод о том, что один и тот же фрагмент Sau, имеющий длину 268 bp, содержит последовательности, способные в зависимости от окружающих их последовательностей либо репрессировать, либо активировать транскрипцию рядом расположенных генов. Наличие
706 ЧУРИКОВ и др.
(а)
gypsy
(б)
Рис. 4. Предлагаемая модель взаимодействия энхансера с оксюмороном и промотором в присутствии инсулятора. а -расположение элементов в конструкции Б -е^-^ б - образование петель фибриллами хроматина при
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.