ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2012, том 59, № 2, с. 274-283
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ГАЛАКТОЗИДАЗА РАСТИТЕЛЬНЫХ ВОЛОКОН С КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКОЙ ЖЕЛАТИНОЗНОГО ТИПА: ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ
© 2012 г. Н. Е. Мокшина, Н. Н. Ибрагимова, В. В. Сальников, С. И. Аменицкий, Т. А. Горшкова
Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики Казанского
научного центра РАН, Казань Поступила в редакцию 21.03.2011 г.
С помощью комплекса подходов идентифицирована тканеспецифичная в-галактозидаза флоэмных волокон льна (Ыпыт usitatissimum Ь.), формирующих клеточную стенку желатинозного типа. Выявлена активация экспрессии гена этого фермента при переходе волокон к формированию клеточной стенки желатинозного типа. С помощью наработанных антител продемонстрирована локализация фермента во флоэмных волокнах льна, где он обнаруживается совместно с тканеспецифичным га-лактаном в секретируемых пузырьках аппарата Гольджи и во вторичной клеточной стенке желатинозного типа. Установлено наличие аналогичной Р-галактозидазы в клеточной стенке желатинозного типа волокон растений различной таксономической принадлежности и образуемых различными меристемами, что указывает на наличие у них сходных механизмов формирования клеточных стенок желатинозного типа и существенную роль в них Р-галактозидазы. Обсуждается роль фермента в формировании надмолекулярной структуры клеточной стенки желатинозного типа.
Ключевые слова: Ыпыт шиа^тыт — растительные волокна — клеточная стенка желатинозного типа — в-галактозидаза — галактан
ВВЕДЕНИЕ
Вторичную клеточную стенку формируют клетки, основной функцией которых является механическая. Известны два основных типа вторичной клеточной стенки [1]: ксилановый, характеризующийся, в частности, высоким содержанием ксилана и лигнина, и желатинозный, который формируется у многих растительных волокон, наряду со слоями "обычной" (ксилано-вой) природы. Благодаря специфичной конструкции клеточной стенки желатинозного типа, волокна могут играть роль своеобразных "мускулов" [2], позволяющих, в частности, растению возвращаться в вертикальное положение, если оно по каким-то причинам нарушено.
У флоэмных волокон для клеточной стенки желатинозного типа характерна модификация структуры отложенных слоев: сначала откладывается более "рыхлый" слой Оп, который затем трансформируется в более "плотный" О [3]. Процессы трансформации слоев вторичной клеточной стенки волокон льна связаны, вероятно, с ме-
Сокращение: ВЭЖХ МС/МС — высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спек-трометрией.
Адрес для корреспонденции: Горшкова Татьяна Анатольевна. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Электронная почта: gorshkova@mail.knc.ru
таболизмом стадия- и тканеспецифичного галак-тана. Этот полисахарид построен как сложный рамногалактуронан I с боковыми цепями, состоящими, в основном, из Р-(1 ^ 4)-связанной галактозы, которая составляет основную массу полимера. В стебле льна высокомолекулярный полимер обнаруживается только ниже "точки слома", которая служит маркером перехода от стадии интрузивного роста волокон к утолщению их клеточной стенки. После встраивания галакта-на в клеточную стенку происходит значительное уменьшение его молекулярной массы [4], что может быть связано с укорочением боковых цепей полимера.
Теоретически гидролиз боковых цепочек га-лактана in vivo возможен в результате действия эндогенной галактозидазы и/или эндогалактана-зы. Выявление в участках стебля, содержащих волокна на стадии формирования вторичной клеточной стенки, высокого содержания галактозы и отсутствие ее олигомеров позволили предположить наличие в тканях стебля льна ниже "точки слома" Р-галактозидазной активности и отсутствие эндогалактаназной [5]. С использованием микрочипов кДНК показано, что при смене стадий развития флоэмных волокон льна от интрузивного роста к формированию вторичной клеточной стенки желатинозного типа существенно возрастает содержание мРНК гена Р-галактози-
дазы [6, 7]. Обнаружен полипептид, продукты трипсинолиза которого имеют гомологию с транслированной последовательностью гена Р-галактозидазы [8].
Целью данной работы была дальнейшая характеристика фермента, осуществляющего постсинтетические модификации тканеспецифичного га-лактана, при этом основной акцент ставился на установление локализации белка и оценку наличия аналогичного фермента в волокнах растений других таксономических групп.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Объектом исследований служили растения льна-долгунца (Linum usi-tatissimum L.) сорта Могилевский из коллекции ВНИИ льна (Торжок). Растения выращивали в условиях вегетационного опыта в ящиках со слоем почвы 50 см на открытом воздухе при естественной освещенности и ежедневном поливе. Образцы фиксировали в период быстрого роста растений (30-40 дней после посева). В качестве ориентира для фиксации образцов было выбрано положение на стебле "точки слома", которая служит маркером перехода волокон от стадии интрузивного удлинения (выше "точки слома") к стадии формирования вторичной клеточной стенки (ниже "точки слома") [9].
Для получения препаратов галактана и ассоциированного с ним белка использовали волокнистую часть 10-сантиметровых участков стебля льна ниже "точки слома". Для выделения тотальной РНК использовали 1-сантиметровые участки стебля на расстоянии 1 см выше и ниже "точки слома". Для установления локализации Р-галак-тозидазы и галактана методами иммуноцитохи-мии фиксировали участки стебля льна в средней части отрезков выше и ниже "точки слома". Для установления локализации Р-галактозидазы в растениях разных таксономических групп использовали участки из средней части стебля конопли (Cannabis sativa L.) и древесины натяжения тополя (Populus trémula L. х P. tremuloides Michx. Возраст растений конопли - 65 дней, растения выращивали на экспериментальном поле НИ-ИСХ (Цивильск, Чувашия). Возраст растений тополя — 3 года; продолжительность гравистимуля-ции — 19 дней, растения предоставлены сотрудниками лаборатории генетики леса и физиологии растений Университета сельскохозяйственных наук (Умеа, Швеция).
Выделение тканеспецифичного галактана и ассоциированного с ним белка. Пробы растительного материала гомогенизировали в жидком азоте с добавлением 10 мМ Na-ацетатного буфера (рН 5.5) и ингибиторов протеаз ("Sigma", США). Гомогенат осветляли центрифугированием при
8000 g 20 мин, полимеры осветленного гомогената осаждали 80% этанолом при 4°С в течение ночи. Полученный осадок отделяли центрифугированием 8000 g при 4°С 10 мин. Из осадка полимеры экстрагировали 10 мМ Na-ацетатным буфером (рН 5.5) с добавлением ингибиторов протеаз в течение 10 мин при комнатной температуре и разделяли на колонке с сефарозой CL-4B (0.9 х 90 см, "Pharmacia", Швеция), скорость элюции 0.3 мл/мин при 8°С в том же буфере, объем фракции 1.85 мл. В качестве маркеров молекулярной массы использовали пуллуланы (1600, 400, 200 и 100 кД, "Waters", США) и голубой декстран (2000 кД, "Pharmacia"). Содержание углеводов во фракциях определяли с помощью фенольного метода
[10], концентрацию белка — по методу Bradford
[11]. Во фракции, содержащие высокомолекулярный галактан (900—2000 кД), добавляли ингибитор протеаз и фракции объединяли.
Постановка одномерного электрофореза по
Laemmli. Белки из препарата высокомолекулярного галактана осаждали ацетоном в соотношении 1 : 5 при -20°С и центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Электрофорез белков проводили в денатурирующих условиях в 10% Na-ДДС-ПААГ [12] с использованием мини-камеры VE-1M ("Хеликон", Россия).
Анализ аминокислотной последовательности белка методами биоинформатики. Нуклеотидную последовательность гена Р-галактозидазы льна (HQ902252) [8] транслировали с помощью программы сайта www.molbiol.ru/scripts/01_13.html. Поиск консервативного домена проводили в базе данных www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb.cgi. Локализацию белка и наличие сигнального пептида устанавливали с помощью программ TargetP (www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) и SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). Наличие трансмембранных доменов анализировали с помощью программы TMHMM (www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/). Поиск ближайших гомологов проводили с помощью BLASTP (www.blast.nc-bi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Принадлежность белка к семейству устанавливали с помощью CAZY (www.cazy.org).
Оценка уровня экспрессии методом ПЦР в реальном времени Тотальную РНК выделяли с использованием кита RNeasy Plant Mini Kit ("Qiagen", Германия) в соответствии с инструкцией производителя (www1.qiagen.com/literature/ render.aspx?id=352). Синтез кДНК из 1—2 мкг общей РНК проводили путем проведения реакции обратной транскрипции, согласно протоколу www.sileks. com/main/descr/pdf/RTMMLV.pdf. Праймеры конструировали с помощью программы VECTOR NTI8. При дизайне праймеров для проведения ПЦР в реальном времени с целью исключения неспецифического отжига праймеров избегали
участков генома, кодирующих консервативные домены.
В качестве гена внутреннего контроля реакции использовали ген "домашнего хозяйства" — актин (AY857865.1, "NCBI"). Праймеры ПЦР и Taq-Man-зонды: LuGAL, F 5'-GCCAGAGTGT-GAAGCTAAAT- 3' и 5'-GTTGGTGTACAAGGT-GAAA-3' R; LuGAL-зонд, 5'-(FAM-G)-CGCCTCTG( BHQ1 -T)TGGTCTTGCGA- 3'; актин, F 5'- GACCTTCAATGTTCCCGCCA-3' и 5'-CATACTgTgCCAATCTACgAAGGG-3' R; актин-зонд 5'-(FAM-C)ACCATCACCAgAA(BHQ1-T)CCAgCACAATACCAG-3'. ПЦР в реальном времени проводили, согласно протоколу www.sileks. com/main/descr/pdf/RTMMLV.pdf. Амплификацию и детекцию ПЦР продуктов в реальном времени проводили на приборе ICycler IQ-4 ("BioRad", США) при следующих условиях: 95°C — 3 мин; 40 циклов 94°C - 30 с, 55°C - 15 с, 65°C -30 с; 70°C — 2 мин. Общий реакционный объем составил 25 мкл.
Получение поликлональных антител. Для получения антигена выделяли высокомолекулярную фракцию полимеров, как описано выше, и проводили электрофоретическое разделение содержащихся в ней белков.
Для накопления необходимого количества белка электрофоретическое разделение белков,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.