научная статья по теме ГАЛЕКТИН-3 МОДУЛИРУЕТ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ TH17 И РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ IN VITRO Биология

Текст научной статьи на тему «ГАЛЕКТИН-3 МОДУЛИРУЕТ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ TH17 И РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ IN VITRO»

ГАЛЕКТИН-3 МОДУЛИРУЕТ ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Th17 И РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ

IN VITRO

Васильева О. А.

ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства

здравоохранения РФ, Томск, Россия

Исследовано влияние рекомбинантного галектина-3 на продукцию ключевых профильных цитокинов Th17 лимфоцитов (IL-17A, IL-22) и регуляторных Т-клеток (TGF-^1, IL-10). Материалом исследования служили мононуклеарные лейкоциты периферической крови здоровых людей. В экспериментах in vitro впервые установлено, что под действием рекомбинантного галектина-3 (0.5 мкг/мл) происходит стимуляция синтеза IL-17A, IL-22 и угнетение продукции IL-10 и TGF-^1. При увеличении концентрации галектина-3 до 1 мкг/мл стимулирующий эффект ослабевает, и начинает преобладать неспецифическое ингибиру-ющее действие на продукцию цитокинов лимфоцитами.

Ключевые слова: галектин-3, Th17 лимфоциты, Т-регуляторные клетки, цитокины

Введение. Основной подход для идентификации и изучения эффекторных функций субпопуляций Т-хелперов заключается в оценке спектра продуцируемых ими цитокинов, который на самом деле есть ключевой показатель, характеризующий их природу и функцию [1]. К настоящему времени доказано, что подавляющее большинство иммунорегуляторных эффектов опосредовано цитокинами. Цитокины регулируют амплитуду и продолжительность воспалительного и иммунного ответов, они действуют в очень низких концентрациях, связываясь с высокоаффинными рецепторами. Избыточная или недостаточная продукция цитокинов является одним из звеньев патогенеза многих заболеваний [2]. Основываясь на этом, уже разработаны и апробированы как рекомбинантные препараты цитокинов, так и антицитокиновые препараты, и в настоящее время ведется поиск новых регуляторов иммунологического баланса.

В качестве регулятора Т-клеточного гомео-стаза в данной работе исследуется низкомолекулярный белок семейства лектинов - галектин-3, секретирующийся клетками лимфоузлов, тимуса, селезенки, макрофагами, дендритными, эпителиальными и опухолевыми клетками. Галектин-3 функционирует как экстрацеллюляр-ная молекула и принимает участие в активации различных типов клеток, таких как моноциты, макрофаги, тучные клетки, нейтрофилы

и лимфоциты [3]. Th17 лимфоциты и Foxp3+ Т-регуляторные клетки (Трег) - это две субпопуляции Т-хелперов, имеющих патогенетическое значение в развитии аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний. Формирование этих клонов лимфоцитов взаимно регулируется при участии нескольких положительных и отрицательных регуляторных сетей [4]. Галектин-3 является многофункциональной молекулой, однако малоисследованной остается его роль в регуляции эффекторных функций Т-лимфоцитов. Цель исследования: установить особенности регуляторного влияния галектина-3 на цитокинпродуцирующую функцию Th17 лимфоцитов и регуляторных Т-клеток in vitro.

Материал и методы. В исследовании использована периферическая кровь практически здоровых людей обоего пола (n = 9) в возрасте от 19 до 32 лет. Взятие крови производили утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К3-ЭДТА. Из крови методом градиентного центрифугирования выделяли мононуклеар-ные лейкоциты. Количество выделенных клеток стандартизировали до 2.0 х 106/мл, разбавляя полной питательной средой, состоящей из 90% RPMI-1640 (ЗАО «Вектор», Россия), 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ООО «Биолот», Россия), 0.3 мг/мл L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина. Клетки

Тематический выпуск «Российский научный форум на Урале»

271

культивировали с рекомбинантным галекти-ном-3 (0.5 и 1.0 мкг/мл, «RnDSystems», США) вместе с активирующими антителами: aHra-CD3 и анти-CD28 («BD Pharmingen™», США) в 48-лу-ночных стерильных планшетах («BD Falcon™», США) в течение 72 ч в СО2-инкубаторе. За 4 ч до окончания инкубации в культуры клеток добавляли стимуляторы синтеза цитокинов фор-болмиристилацетат (50 нг/мл, Tocris Bioscience, США) и иономицин кальция (1 мкг/мл, Tocris Bioscience, США), после чего среду с клетками переносили в пробирки, центрифугировали 10 мин при 1500 об./мин и собирали супернатант для детекции количества цитокинов. В качестве контроля использовали мононуклеарные лейкоциты, которые культивировали в аналогичных условиях, но без добавления галекти-на-3 в питательную среду. Определение уровня продукции интерлейкинов (IL) 17А, IL-10, IL-22 и TGF-^1 в культуральных супернатан-тах осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» согласно протоколам фирмы-производителя («RnDSystems», США). В случае получения значений, превышающих диапазон линейности набора, производилось кратное разведение образцов (от 2 до 10 раз) и повторное проведение анализа с умножением результата на фактор разведения. Оценку нормальности распределения полученных результатов проводили с использованием критерия Шапиро Вилка. Достоверность различий (Р < 0.05) оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона для зависимых выборок. Данные представлены в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q25-Q75).

Результаты. Для изучения влияния рекомби-нантного галектина-3 на функциональную активность Т-лимфоцитов хелперов in vitro были использованы две концентрации лектина (0.5 и 1.0 мкг/мл), подобранные в ходе предварительных экспериментов, как описано ранее [7].

Концентрация IL-17A - основного цитокина, продуцируемого Th17 лимфоцитами,- в контрольной группе на третьи сутки культивирования составила 5492,5 (4647,8-6643,5) пг/мл. При этом действие галектина-3 на продукцию данного цитокина оказалось сильно зависимым от дозы, а именно, при действии 0,5 мкг/мл галектина-3 происходило статистически значимое увеличение концентрации IL-^А в супернатантах клеточных культур (6568,5 (5314,4-8020,6) пг/мл) (р=0,011), тогда

как влияние галектина-3 в дозе 1 мкг/мл характеризовалось 3-х кратным снижением содержания ГЬ-17А (1802,5 (832,2-3046,7) пг/мл) относительно значений показателя в контрольной группе (р=0,011) и опыте с меньшей концентрацией лектина (р=0,007).

Схожие изменения наблюдались в продукции ^-22, который также является профильным цитокином ^17 лимфоцитов. Под влиянием галектина-3 в дозе 0,5 мкг/мл происходило увеличение продукции ГЬ-22 в 2,5 раза относительно контроля (1061,3 (234,0-1150,4) пг/мл) и составило 2714,0 (603,1-3383,1) пг/мл (р=0,017). С увеличением дозы галектина-3 до 1 мкг/мл отмечалось достоверное (р=0,017) снижение концентрации ^-22 в супернатантах по сравнению с действием галектина-3 в меньшей дозе, однако уровень ^-22 (1201,3 (501,3-1417,6) пг/мл) оставался достоверно выше такового в контрольной культуре клеток (р=0,017).

Для установления влияния галектина-3 на функциональную активность Т-регулятор-ных лимфоцитов была проведена оценка концентрации двух супрессорных цитокинов: ГЬ-10 и TGF-pl. При исследовании влияния галектина-3 на концентрацию ГЬ-10 было выявлено значительное снижение содержания данного цито-кина. При добавлении в культуральную среду исследуемого лектина в дозе 0,5 мкг/мл уровень ±-10 составил 453,4 (137,3-823,4) пг/мл, а в дозе 1 мкг/мл - 203,4 (76,5-466,7) пг/мл, что, соответственно, в 4,8 и 10,8 раза ниже (р=0,005) значений данного показателя в группе контроля (2204,8 (1574,5-2391,9) пг/мл). Содержание трансформирующего ростового фактора (31 при действии обеих тестируемых концентраций галектина-3 достоверно снижалось по сравнению с группой контроля, но различий в зависимости от дозы выявлено не было. В контрольной группе содержание TGF-pl в данных условиях культивирования составило 17444,3 (15596,0-23109,3) пг/мл, а при действии галектина-3 в дозах 0,5 и 1,0 мкг/мл концентрация цитокина уменьшилась, соответственно, до 13789,3 (11314,3-17941,0) и 15716,0 (13251,0-17439,3) пг/мл.

Обсуждение. Галектин-3 относится к семейству животных лектинов, способных распознавать (3-галактозу. Интерес к исследованию галектина-3 обусловлен его участием в регуляции клеточного цикла, цитокинопос-редованной межклеточной коммуникации, адгезии и опухолевой трансформации клеток.

В настоящее время данный лектин рассматривается в качестве перспективной терапевтической мишени при аутоиммунных, аллергических и опухолевых заболеваниях [6].

В данном исследовании была проведена оценка влияния рекомбинантного галектина-3 на продукцию основных цитокинов Th 17-лимфоцитами (IL-17A, IL-22) и T-регуляторными клетками (IL-10, TGF-^1). В ходе экспериментов in vitro было установлено, что галектин-3 в дозе 0,5 мкг/мл стимулирует выработку IL-17A и IL-22 при одновременном угнетении синтеза IL-10 и TGF-^1. Увеличение дозы исследуемого лектина до 1,0 мкг/мл сопровождалось усилением ингибирующего действия на продукцию IL-10, а также подавлением секреции IL-17A и IL-22, что, вероятнее всего, обусловлено индукцией апоптоза СБ4+-лимфоцитов. Синтез исследуемых цитокинов контролируется транскрипционными факторами, определяющими дифференцировку Th17 и регуляторных Т-клеток, Rorc и FoxP3, соответственно [1]. Равновесие между экспрессией этих транскрипционных факторов играет критическую роль в определении, будут ли наивные CD4+-лимфоциты дифференцироваться в Трег или в Th17 [7]. Ранее нашей научной группой было показано усиление экспрессии мРНК гена RORC и подавление экспрессии гена FOXP3 в мононуклеарных лейкоцитах под влиянием галектина-3 в дозе 0,5 мгк/мл [5]. Таким образом, при действии галектина-3 прослеживается четкая зависимость между реализацией эффек-торных функций и уровнем экспрессии мРНК контролирующих генов Th17 и Т-регуляторных лимфоцитов, с преобладанием процесса диф-ференцировки и усилением функциональной активности Th17 клеток. Полученные нами данные in vitro подтверждаются in vivo. Так на мы-

шиной модели аутоиммунного гепатита показано, что галектин-3 усиливает продукцию IL-17A и снижает концентрацию IL-10, а также индуцирует апоптоз мононуклеарных лейкоцитов, что сопровождается более тяжелым течением болезни [8]. Повышенный уровень галектина-3 обнаруживался в сыворотке у людей, страдающих такими аутоиммунными заболеваниями, как ревматоидный артрит, сис

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком