МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 1, с. 39-47
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582:28.013(99)
ГАЛОПСИХРОТОЛЕРАНТНЫЕ ГРИБЫ РОДА вЕОИУСЕЗ ИЗ КРИОПЭГОВ И МОРСКИХ ОТЛОЖЕНИЙ АРКТИКИ
© 2007 г. Г. А. Кочкина1*, Н. Е. Иванушкина*, В. Н. Акимов*, Д. А. Гиличинский**,
С. М. Озерская*
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино
Поступила в редакцию 17.04.2006 г.
В настоящем исследовании сравнительной характеристике были подвергнуты изоляты рода Geomy-ces из криопэгов и вмещающих их древних морских отложений Арктики, многолетнемерзлых пресных грунтов и штаммы из умеренных местообитаний. Принадлежность изолятов к виду Geomyces pannorum подтверждена как микробиологическими (культурально-морфологическими), так и моле-кулярно-биологическими методами. Показано, что по способности к росту при отрицательной (-2°С) температуре и одновременно повышенном содержании соли (10%) в среде изоляты из криопэгов и вмещающих их морских отложений отличаются от культур того же вида, выделенных из пресных грунтов и умеренных местообитаний. Полученные результаты обсуждаются в связи с вероятным наследованием адаптационных возможностей, приобретенных в специфической среде обитания.
Ключевые слова: Geomycespannorum, многолетнемерзлые грунты, криопэги.
Криопэги представляют собой высокоминерализованные отрицательно-температурные воды, которые могут существовать на протяжении геологически значимого времени. Нами изучены линзы криопэгов, обнаруженные в Арктике на Колымской низменности (побережье ВосточноСибирского моря, район озера Якутское на глубинах 12-30 м, рис. 1а). Они приурочены к морскому горизонту (mQII) мощностью 20 м, накопление которого шло в прибрежной морской лагуне. После регрессии Полярного бассейна в конце среднего плейстоцена (100-120 тыс. лет назад), водонасы-щенные донные отложения перешли в субаэраль-ное состояние и промерзли. Промерзание сопровождалось вымерзанием солей из осадков в воду и образованием рассолов, незамерзающих при отрицательных температурах. Криопэги - это уникальная гидрологическая система, которая характеризуется постоянными температурами ниже нуля (с колебаниями -9-11°С), высокой соленостью (170-300 г/л) и изоляцией от воздействия внешних факторов на протяжении всей их геологической истории [1].
Известно, что отрицательные температуры мерзлых толщ, при которых скорости биохимических реакций и биологических процессов становятся предельно низкими, не лимитируют сохранение жизнеспособности. Интерес к изучению микробного сообщества криопэгов обусловлен тем, что сохранение жизнеспособных организмов
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: gak@dol.ru).
в водной среде на протяжении геологического времени имеет общебиологическое и астробио-логическое значение.
Криопэги населены микроорганизмами, общая численность которых не отличается от таковой в современных водоемах. В настоящее время показано, что обитающее здесь психрофильное галофильно-галотолерантное сообщество прокариот метаболически активно при отрицательных температурах и высокой солености [1]. Среди бактерий, обитающих в криопэгах, были обнаружены психрофильные микроорганизмы родов Clostridium и Psychrobacter, включая новые виды [2]. Наши исследования показали существование галопсихротолерантного сообщества мицелиаль-ных грибов криопэгов [3]. Изолированные из этого местообитания микромицеты были отнесены к 12 различным таксонам преимущественно ана-морфных грибов. Особое место среди выделенных грибов занимают микромицеты вида Geomyces pannorum. Эти грибы, не являясь ни истинными га-лофилами, ни истинными психрофилами, по нашим данным, лучше других адаптированы к существованию в условиях криопэгов, характеризуются высокой встречаемостью и обилием (75% от всех изолятов). Именно эти организмы были выделены при использовании питательных сред с высоким содержанием NaCl (до 20%) [4]. Geomyces pannorum и Geomyces vinaceus встречаются не только в Арктике, они широко распространены и в Антарктическом регионе. Так, при исследовании Антарктиды в районе моря Росса они были обнаружены
-г-оо-: 1 / / / 3 = 11Ш 11Ш1111 : Ж ® ч Ое)
/ / / 2 4 "Е-"' 5 6 у V 7 8 9
Рис. 1. Геологический разрез иоздиекайнозойских отложений: а - побережье Восточно-Сибирского моря, б - междуречье рек Б. Чукочья и М. Коньковая. 1 - супесь, 2 - суглинок, 3 - переслаивание супеси и песка, 4 - песок, 5 - отор-фованные горизонты, 6 - полигонально-жильный лед, 7 - псевдоморфозы по полигонально-жильным льдам, 8 - морская фауна, 9 - линзы криопэгов, 10 - скважины.
в 8 из 10 изученных почвенных образцов [5]. Представители рода Овотуовз были найдены в районе полуострова Поттер в Антарктиде [6]. Все это вызывает особый интерес к грибам этого рода в плане изучения адаптационных возможностей с целью попытки ответа на основной вопрос: способны ли грибы этого рода только сохранять свою жизнеспособность или могут активно развиваться в экстремальных условиях криопэгов. Кроме того, высокая вариабельность штаммов внутри вида Овотуовз раппогит, выражающаяся не только в особенностях их культурально-мор-фологических признаков, отношении к температуре, но и в способности к существованию в самых разных экологических нишах, побуждает использовать молекулярные методы для выявления возможных сходств или различий между культурами, изолированными из различных источников.
Цель работы - изучение развития грибов рода Овотуовз в экстремальных температурных и осмотических условиях. Штаммы этого рода, выделенные из разных биотопов и имеющие существенные культурально-морфологические отличия, сравниваются на основе результатов молекуляр-но-генетического анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение влияния температуры культивирования и разных концентраций №С1 на рост штаммов рода Овотуовз проводили для культур, выделенных из разных местообитаний: 4 - из криопэгов и 2 - из вмещающих их многолетне-мерзлых морских отложений. Для сравнения были взяты 2 штамма из образцов, отобранных в средней полосе России и 2 штамма, выделенные на Колымской низменности из многолетнемерз-лых незасоленных отложений Арктики голоцено-вого (скв. 1/93) и позднеплиоценового (скв. 2/89) возраста (рис. 16, табл. 1).
В экспериментах по изучению развития грибов рода Овотуовз, выделенных из криопэгов и морских отложений, при низких температурах и повышенном содержании солей в среде, споровую суспензию (около 1 млн. спор/мл) наносили тремя уколами в чашках Петри в среду Чапека с 10% №С1 и без соли. Для каждого штамма измеряли диаметры 12 колоний в динамике их развития. Результаты обрабатывали статистически. Культивирование вели при разных температурах: -2, 0, 4 и 2б°С. Прорастание спор оценивали мик-
Таблица 1. Штаммы Geomycespannorum, изученные в работе
Номер штамма в ВКМ Номер нуклео-тидной последовательности в GenBank * Место и источник выделения
ВКМ F-3808 AY873968 Средняя полоса Российской Федерации Шерсть полевки рыжей (Cletrionomus glareolus), Россия, Тверская обл., Стариц-кий район, Крутицы
FW-1103 DQ189226 То же Дерново-подзолистая почва, картофельное поле, Россия, Московская обл., Звенигород
FW-751 DQ189227 Пресные многолетнемерзлые пойменные отложения, возраст - 5-8 тыс. лет Скв. 1/93 (глубина 4.0 м), Россия, Колымская низменность, пойма р. М. Коньковая (69°23' с.ш., 158°28' в.д.)
FW-969 DQ 189225 Пресные многолетнемерзлые озерно-аллювиальные отложения олерской свиты, возраст 1.8-2.0 млн. лет Скв. 2/89, Россия, Колымская низменность, среднее течение р. Б. Чукочья (69°29' с.ш.,156°59' в.д.)
FW-857 DQ 189229 Криопэги, возраст100-120 тыс. лет Скв. 14/99, Россия, Колымская низменность, оз. Якутское (69°59' с.ш., 159°30' в.д.)
FW-2236 FW-2238 FW-2241 DQ 189228 AY873965 AY873966 То же То же То же Скв. 15/99, Россия, Колымская низменность, оз. Якутское (69°59' с.ш., 159°30' в.д.)
FW-2260 FW-2264 DQ 189224 AY873967 Засоленные морские многолетнемерз-лые отложения коньковской свиты, возраст 100-120 тыс. лет Скв. 14/99, (глубина 14.42-15.46 м), Россия, Колымская низменность, оз. Якутское (69°59' с.ш., 159°30' в.д.)
* GenBank. http://www.ncbLnlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide.
роскопически (Х160-400). При этом фиксировали образование ростовой трубки от 2 мкм и более. Длительность экспериментов зависела от условий культивирования и колебалась от 30 до 80 сут.
Описание культурально-морфологических признаков всех штаммов проводили при их росте на средах Чапека и Мальц-агаре (МА) согласно обычной методике на 14-е сут [7].
Суммарную ДНК из мицелия грибов выделяли по методу, предложенному Cenis [8]. Осуществляли секвенирование эволюционно лабильных последовательностей ITS1 и ITS2 и эволюционно консервативных последовательностей гена 5.8S рРНК В качестве праймеров для ПЦР-амплифи-кации исследуемого участка рРНК оперона использовали:
ITS1 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' и ITS4 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'. ПЦР проводили на приборе GeneAmp PCR System 2700 ("Applied Biosystems", США) в 25 мкл смеси, содержащей: 2.5 мкл 10-кратного ПЦР-буфера ("Fermentas", Литва), 1.5 мкл 25 мМ MgCl2; 2.5 мкл смеси из 4 де-зоксирибонуклеозид-трифосфатов (2.5 мМ каждый); по 1 мкМ праймеров ITS1 и ITS4; 0.025 мкг геномной ДНК; 0.5 единицы активности ДНК-по-лимеразы Taq ("Fermentas", Литва). После предва-
рительной денатурации (94°C, 3 мин) проводили 30 циклов амплификации в следующих условиях: денатурация (94°C, 30 с); отжиг (55°C, 30 с); синтез (72°C, 80 с).
Нуклеотидную последовательность амплифи-цированного участка рРНК оперона определяли на автоматическом ДНК секвенаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США) в соответствии с предлагаемым фирмой протоколом.
Поиск близких нуклеотидных последовательностей осуществляли в базе данных GenBank с помощью программы BLASTn. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программу ClustalX [9]. Матрица эволюционных расстояний построена по алгоритму Jukes et Cantor [10]. Для построения филогенетического древа использована программа TREECON [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ И
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.