ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 440, № 5, с. 701-703
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.2.04:577.112
гапонин - новый белок, регулирующим клеточный ответ
на окислительный стресс © 2011 г. Е. В. Смирнова, Т. В. Ракитина, О. В. Богатова, Д. Л. Иванова, Е. Е. Воробьёва,
А. В. Липкин, И. А. Костанян, член-корреспондент РАН В. М. Липкин
Поступило 30.05.2011 г.
Ранее в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии РАН был выделен и охарактеризован новый белок га-понин (МР_115701.2) [1]. В ходе исследований га-понина получена его экспрессия в бакуловирус-ной системе, наработаны и очищены поликло-нальные антитела к гапонину, с помощью которых выявлена экспрессия эндогенного белка в клеточных линиях различного происхождения, а также проведен поиск белковых партнеров гапонина [2].
Для дальнейшего функционального изучения гапонина нами создана панель генетически модифицированных клеточных линий с измененными уровнями экспрессии белка (табл. 1). Панель включала клеточные линии, сверхэкспрессирую-щие гапонин, слитый с зеленым флуоресцентным белком (ОБР), клетки, сверхэкспрессирующие га-понин дикого типа параллельно с ОБР, и клетки, в которых экспрессия гапонина подавлена с помощью коротких интерферирующих РНК (киРНК) [3]. Для получения данной панели клетки линий СНО-К1 и НЕК-293 трансфецировали перечисленными в табл. 1 экспрессионными конструкциями. Стабильные гетерогенные клеточные линии получали селекцией на соответствующих антибиотиках.
Уровень экспрессии гапонина в полученных клеточных линиях анализировали иммуноблот-тингом с поликлональными антителами к гапонину. На рис. 1 приведены результаты иммуноблоттинга, демонстрирующие значительное увеличение уровня экспрессии гапонина в клетках НЕК-ОБР&Нар, сверхэкспрессирующих гапонин дикого типа, по сравнению с контрольными клетками НЕК-ОБР с нормальным уровнем экспрессии белка (дорожки 1 и 2 соответственно), а также заметное сниже-
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт", Москва
ние уровня экспрессии гапонина в результате действия киРНК в клетках HEK-siHap по сравнению с контрольными клетками HEK-siCont (дорожки 3 и 4 соответственно).
Клеточные линии, экспрессирующие слитый белок GFP-Hap, использовали для изучения субклеточной локализации гапонина с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии на инвертированном микроскопе Nikon TE-2000 (Япония), снабженном конфокальной лазерной системой. Для визуализации клеточного ядра применили флуоресцентный краситель 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Результаты исследований, представленные на рис. 2, демонстрируют, что в клетках, экспрессирующих GFP-гапонин, интенсивность зеленой флуоресценции в области ядра заметно увеличена по сравнению с контрольными клетками, в которых флуоресценция детектировалась равномерно по всей клетке. Сравнение уровней интенсивности флуоресценции в области ядра и цитоплазмы, проведенное с помощью программы ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/) на слу-
p a
Ha
Рч Рч & св Й о
ь ь Д О
О О 'Й 'Й
¡4 ¡4 а а
- - - -
H H я H
P-Act
Hap
Рис. 1. Анализ уровня экспрессии гапонина в стабильных клеточных линиях HEK-GFP&Hap, HEK-GFP, HEK-siHap и HEK-siCont с помощью имму-ноблоттинга. Тотальные клеточные лизаты (10 мкг) разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ и переносили на PVDF-мембрану. Использовали поликло-нальные кроличьи антитела к гапонину (Hap, нижняя панель) и Р-астину ф-Act, верхняя панель) для нормализации количества нанесенного белка и соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена.
702 СМИРНОВА и др.
Таблица 1. Создание клеточных линий с измененными уровнями экспрессии гапонина
Исходные клеточные линии Плазмидные эукариотические экспрессионные векторы, промоторы, устойчивость к антибиотикам (производитель) Полученные плазмидные конструкции1 Выведенные гетерогенные стабильные клеточные линии Контрольные линии
CHO-K1 HEK-293 рЕОБР-С1, СМУ, О418 ("С1оПесЬ", США) pSilencer-4.1, СМУ, пуроми-цин ("АшЫоп", США) pGFP-Hap2 pGFP&Hap3 psiHap4 CHO-GFP-Hap HEK-GFP-Hap HEK-GFP&Hap HEK-siHap CHO-GFP HEK-GFP HEK-siCont5
Примечание. 1 — правильность полученных плазмидных конструкций подтверждали автоматическим секвенированием ("Евроген", Москва); 2 — кДНК гапонина амплифицирована и встроена после кДНК GFP с сохранением рамки считывания и получением слитого гена GFP-Hap; 3 — кассета, состоящая из CMV-промотора, кДНК гапонина и сигнала полиаденилирования SV-40, встроена после GFP-экспрессирующей кассеты, так чтобы оба белка экспрессировались независимо; 4 — в качестве киРНК для гапонина выбрана последовательность 5'-AAATACCGCAAGAACATCTGG-3' (21 п.о.), которая соответствовала 165—185 нт от AUG-кодона в мРНК гапонина, которую вводили в плазмиду pSilencer ("Ambion") согласно рекомендациям производителя; 5 — для получения HEK-siCont использовали плазмиду pSilencer 4.1-CMV puro Negative Control ("Ambion", США), несущую последовательность киРНК, не имеющую гомологии в геноме млекопитающих.
чайной выборке из 30 клеток, показало, что соотношение ядерного и цитоплазматического ОБР-гапонина в клетках СНО-К1 составляло 3.5 ± 0.6 и 1.2 ± 0.4 для ОБР. Аналогичные результаты получены для клеток НЕК-ОБР-Нар, кроме того, им-мунофлуоресцентное окрашивание эндогенного гапонина в клетках линий СНО-К1 и HeLa с помощью поликлональных антител к гапонину подтвердило факт ядерного накопления белка (данные не приведены).
CHO-GFP
CHO-GFP-Hap
Рис. 2. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия стабильных производных СНО-К1, экс-прессирующих ОБР (СНО-ОБР) и ОБР-гапонин (СНО-ОБР-Нар). Ядра клеток визуализированы ВАР1.
Анализ аминокислотной последовательности гапонина выявил наличие в белке двух кластеров, обогащенных положительно заряженными аминокислотами (^КНУУК и KYRKNIWIKR, аминокислотные остатки 6—12 и 56—65 соответственно), сходных с сайтом ядерной локализации, кото-
0 HEK-GFP&Hap HEK-GFP
Выживаемость, % 120
100 80 60 40 20 0 120 100 80 60 40 20 0
0.08
0.17 (б)
0.33
0.67
HEK-siCont HEK-siHap
0.08
0.17
0.33 0.67 H2O2, мМ
Рис. 3. Зависимость выживаемости клеточных линий с измененными уровнями экспрессии гапонина от концентрации Н2О2. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение для трех (а) и четырех (б) независимых экспериментов; р < 0.02.
0
0
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 440 № 5 2011
ГАПOHИH - ТОВЫЙ БЕЛОК
703
рые, вероятно, отвечают за ядерную локализацию гапонина. Ранее нами были получены данные о взаимодействии гапонина с глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназой (ОАРЭН) [2] — ключевым гликолитическим ферментом клетки [4], обладающим широким спектром неканонических функций, не связанных с процессом гликолиза [5]. Следует отметить, что локализованный преимущественно в цитоплазме ОАРЭН в условиях окислительного стресса транслоцируется в ядро [6, 7]. Механизм ядерной транслокации ОАРЭН точно не установлен, но в ряде работ продемонстрирована его проапоптотическая роль, связанная со стабилизацией Е3 убиквитин-лигазы Siah1 [8, 9].
Ядерная локализация гапонина в совокупности с его способностью взаимодействовать с ОАРЭН легли в основу исследований, направленных на определение роли гапонина в клеточном ответе на окислительный стресс, в которых использовали клеточные линии, сверхэкспрессиру-ющие гапонин дикого типа, а также клетки со сниженным уровнем экспрессии гапонина. Окислительный стресс вызывали путем добавления в культуральную среду пероксида водорода (Н2О2). Количество живых клеток определяли через 48 ч после добавления Н2О2 с помощью колориметрического МТТ-теста (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид) [10]. Эксперимент проводили в квадрупликатах. Данные нормализовали на выживаемость контрольных клеток, принимаемую за 100%. Статистический анализ проводили на основе данных, полученных в 3—4 независимых экспериментах.
На рис. 3а приведена диаграмма выживаемости клеток со сверхэкспрессией гапонина и контрольных клеток, экспрессирующих ОБР, а на рис. 3б — диаграмма выживаемости клеток, экспрессирующих киРНК к гапонину, и контрольные киРНК после обработки Н2О2. Результаты эксперимента указывают на то, что повышенная экспрессия гапонина увеличивает чувствительность
клеток HEK-293 к окислительному стрессу, а снижение уровня экспрессии гапонина уменьшает эту чувствительность. Поскольку усиление клеточной гибели в условиях окислительного стресса прямо коррелирует с увеличением уровня экспрессии гапонина, то можно предположить, что белок участвует в проведении апоптотического сигнала, индуцированного активными формами кислорода. Возможно, гапонин благодаря своей способности связывать GAPDH способствует ядерной транслокации последнего, что в свою очередь усиливает сигнальный каскад GAPDH/Siah1/клеточ-ная гибель.
Данная работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант 08-04-01127-а) и программы Российской Академии наук по молекулярной и клеточной биологии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вонаршенко А.В., Радченко В.В., Гапон М.В. и др. // Биоорган. химия. 2007. Т. 33. № 6. С. 653-656.
2. Ракитина Т.В., Богатова О.В., Смирнова Е.В. и др. // Биоорган. химия. 2010. Т. 36. № 3. С. 312318.
3. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. // Genes Develop. 2001. V. 15. № 2. Р. 188-200.
4. Harris J.I., Waters M. In: The Enzymes. 3rd ed. N.Y.: Acad. Press, 1976. V. 13. P. 1-49.
5. Sirover M.A. // Biochim. et biophys. acta. 1999. V. 1432. №2. P. 159-184.
6. Mazzola J.L., Sirover M.A. // J. Neurosci. Res. 2003. V. 71. № 2. P. 279-285.
7. Arutyunova E.I., Danshina P.V., Domnina L.V., et al. // Biochim et Biophys. Res. Communs. 2003. V. 307. № 3. P. 547-552.
8. Hara M.R., Snyder S.H. // Cell. Mol. Neurobiol. 2006. V. 26. № 4-6. Р. 527-538.
9. Yego E.C., Mohr S. // J. Biol. Chem. 2010. V 285. № 5. Р. 3181-3190.
10. Mosmann T. // J. Immunol. Meth. 1983. V. 65. № 1, 2. Р. 55-63.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ ^УК том 440 № 5 2011
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.