УДК 632.488
ГЕН ФОСФАТПЕРМЕАЗЫ КАК МАРКЕР ДЛЯ ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТОКСИГЕННОГО ГРИБА Fusarium cerealis
© 2013 г. А. А. Стахеев, Д. Р. Хайрулина, Д. Ю. Рязанцев, С. К. Завриев#
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 1.10.2012 г. Принята к печати 15.10.2012 г.
На основе последовательностей нуклеотидов гена фосфатпермеазы разработана система высокоспецифичной ПЦР-идентификации фитопатогенного гриба Fusarium cerealis. Секвенирование и последующий анализ показали, что этот ген обладает высокой степенью полиморфизма и может быть использован как для филогенетических исследований, так и в качестве маркера для подбора специфических праймеров. Исследования специфичности разработанных праймеров подтвердили отсутствие перекрестных реакций с ДНК близкородственных видов грибов рода Fusarium. ПЦР в реальном времени продемонстрировала высокую чувствительность тест-системы, составившую 10 пг специфической ДНК на реакцию.
Ключевые слова: Fusarium cerealis, ДНК-маркеры, ПЦР-идентификация, ген фосфатпермеазы.
DOI: 10.7868/S0132342313020140
ВВЕДЕНИЕ
Грибы рода Fusarium являются распространенными по всему миру патогенами злаковых [1, 2]. Заражение фузариозом приводит к существенному снижению количества и качества урожая, а также к накоплению в зерне целого спектра микотоксинов, представляющих угрозу для здоровья человека и животных. Основными факторами, определяющими загрязнение зерна микотоксинами, являются видовой состав развивающихся на нем грибов и их токсигенность. Контроль качества зернопродуктов и обеспечение биологической безопасности требуют регулярного мониторинга зерна не только на наличие токсинов, но и на зараженность их продуцентами — возбудителями фузариоза. Мониторинг последних должен быть основан на методах, позволяющих точно и за короткое время идентифицировать вид гриба и, таким образом, предсказать, накопление каких токсичных метаболитов возможно в анализируемом зерне. Вид Fusarium cerealis (синоним: Fusarium crookwellense) в соответствии с широко используемой на сегодняшний день таксономической системой [3] принадлежит к секции Discolor
Сокращения: ПЦР — полимеразная цепная реакция; ВК — внутренний контроль; РНО — ген фосфатпермеазы; п.о. — пар оснований; RAPD — случайная амплификация полиморфной ДНК (random amplification of polymorphic DNA); Cq — пороговый цикл (quantification cycle); FAMdT — дез-окситимидин, меченый карбоксифлуоресцеином; BHQ1 — гаситель флуоресценции black hole quencher 1.
# Автор для связи (тел.: 8(495)336-4511; электронная почта: szavriev@ibch.ru).
и является близким к видам F. graminearum и F. culmorum. Впервые этот вид был описан в 1971 г. при изучении изолятов грибов рода Fusarium, выделенных из клубней картофеля в округе Крук-вел, Австралия [4]. F. cerealis — космополитный вид, встречающийся в различных природно-гео-графических зонах [5—10]. В России этот вид впервые выделен в чистой культуре в 2009 г. из корней и зерен пшеницы и ячменя, а также из листьев чертополоха на Дальнем Востоке, Северном Кавказе и в Центрально-Черноземном регионе [11]. F. cerealis вызывает корневую гниль и фуза-риоз злаковых [2, 11], способен поражать и другие культуры, являясь причиной гнили стеблей хлопка [7], шишек хмеля [8] и плодов авокадо [9]. Вид характеризуется наличием обильного плотного воздушного мицелия темно-красной или желтоватой окраски. Макроконидии веретеновидно-серповидные, изогнутые, как правило, с пятью перегородками, микроконидии отсутствуют [11]. F. cerealis является гетероталличным видом, штаммы которого характеризуются типами спаривания MAT-1 и MAT-2 [12].
Штаммы гриба F. cerealis являются продуцентами таких микотоксинов, как ниваленол (НИВ) и его ацетилированные производные (трихотеце-ны группы В), а также зеараленон (ЗЕН), фузари-евая кислота и фузарин С [13—16]. В то же время, до сегодняшнего дня не описаны штаммы F. cerealis, продуцирующие дезоксиниваленол (ДОН) [17].
Таблица 1. Моноспоровые штаммы грибов рода Fusarium, использованные в работе
№ Вид Штамм Происхождение Растение-хозяин
1 F. cerealis 64722 Хабаровский край пшеница
2 45765 Китай пшеница
3 45766 Китай пшеница
4 45770 Китай пшеница
5 45775 Китай пшеница
6 45788 Северная Осетия бодяк
7 F. graminearum G.8-8 Германия пшеница
8 48702 Брянская область пшеница
9 58033 Ленинградская область ячмень
10 70725 Орловская область пшеница
11 58212 Приморский край пшеница
12 F. culmorum 74007 Архангельская область картофель
13 58801 Московская область пшеница
14 58030 Ростовская область бодяк
15 70505 Беларусь пшеница
16 50901 Киргизия бодяк
17 F. sporotrichioides 33100 Приморский край пшеница
18 74006 Ленинградская область ячмень
19 64706 Приморский край ячмень
20 78101 Орловская область пшеница
21 F. langsethiae 82901 Орловская область овес
22 55201 Калининградская область овес
23 F. poae 47401 Московская область пшеница
24 61701 Саратовская область пшеница
25 78105 Орловская область пшеница
26 F. avenaceum 74005 Краснодарский край пшеница
27 42301 Северная Осетия пшеница
28 F. tricinctum 30141 Финляндия пшеница
29 70524 Ленинградская область тимофеевка
30 F. equiseti 64414 Калининградская область ячмень
31 64803 Приморский край ячмень
32 F. acuminatum 131802 Иркутская область овес
33 F. torulosum 90604 Ленинградская область ячмень
Высокий токсигенный потенциал F. cerealis [6, 18] и широкое распространение этого вида делают необходимым разработку системы его высокоспецифичной идентификации. Большинство методов определения фитопатогенных грибов основано на исследованиях морфологии изолята, которые требуют выделения чистой культуры гриба, и, как следствие, больших затрат времени и высокой квалификации сотрудников, выполняющих анализ. Кроме того, такой подход не всегда позволяет определять гриб с точностью до вида из-за высо-
кой степени морфологического сходства близко -родственных видов. В частности, по этой причине F. cerealis нередко идентифицируют как F. ш1-morum, F. graminearum или F. pseudograminearum [16].
Решение этих проблем находится в применении альтернативных методов идентификации, в первую очередь, полимеразной цепной реакции (ПЦР). На сегодняшний день ПЦР является наиболее быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом детекции и идентификации фи-
топатогенов, в том числе грибов рода Fusarium [19—25]. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ, или количественная ПЦР [26]) помимо качественного анализа дает также возможность количественной оценки содержания ДНК патогена в образце [27, 28]. Наиболее специфичной модификацией ПЦР-РВ является метод с использованием гидро-лизующихся зондов (TaqMan) [29], который нашел широкое применение для идентификации токсигенных грибов рода Fusarium и анализа зараженного зерна [30—39].
В большинстве исследований, посвященных детекции и идентификации грибов рода Fusarium, мишенями для подбора специфических прайме-ров являются гены "домашнего хозяйства", такие как внутренние транскрибируемые спейсеры рРНК (ВТС), гены бета-тубулина ф-TUB) [40], фактора элонгации трансляции 1 альфа (TEF1a) [41, 42], а также ферментов, участвующих в каскадах синтеза микотоксинов [21, 43]. Однако высокая степень межвидовой гомологии последовательностей нуклеотидов этих генов для видов F. cerealis, F. graminearum, F. pseudograminearum и F. culmorum не позволяет создать праймеры для специфической детекции F. cerealis.
Настоящее исследование посвящено разработке высокоспецифичной системы ПЦР-иден-тификации токсигенного гриба F. cerealis на основе последовательности нуклеотидов гена фос-фатпермеазы (phosphate permease, РНО).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как было сказано выше, локусы, наиболее широко применяемые для разработки систем идентификации грибов рода Fusarium, не обладают степенью полиморфизма, достаточной для разработки праймеров, специфичных к F. cerealis. Лишь для описанного в 2010 г. гена 14-а-деметилазы сте-рола CYP51C [44] показана такая возможность. Также необходимо упомянуть о паре праймеров, разработанной на основе секвенирования специфического продукта RAPD-анализа ДНК F. cerealis
[45]. Продемонстрировано, что описываемые праймеры позволяют дифференцировать F. cerealis и близкородственные виды — F. graminearum и F. culmorum, однако в работе не анализировались штаммы вида F. pseudograminearum, поэтому говорить об абсолютной специфичности праймеров затруднительно. Таким образом, необходимо выявление локуса, обладающего высокой степенью полиморфизма, достаточной для подбора прайме-ров, специфичных к F. cerealis.
Был проведeн анализ последовательностей нуклеотидов нескольких генов, депонированных в GenBank, в частности, трихотецен-3-О-ацетил-трансферазы, гистона Н3, аммонийлигазы и РНО
[46]. Наибольшую степень межвидового поли-
морфизма продемонстрировал ген РНО, кодирующий фосфатпермеазы — транспортный белок, локализованный в мембране митохондрий и катализирующий процесс переноса в матрикс фосфата в симпорте с ионом Н+ [47].
Последовательности нуклеотидов гена РНО, ранее использованные в филогенетических исследованиях секции Sporotrichiella [48], определены лишь для небольшого числа видов грибов рода Fusarium. С целью расширения представлений о полиморфизме этого гена на основе выравнивания депонированных в GenBank последовательностей нуклеотидов (рис. 1) были сконструированы универсальные праймеры (здесь и далее последовательности нуклеотидов приведены в направлении 5'-3'): FusPHOF TCCATYATYACYTCHGAG-TAAGT; FusPHOR: CCACCAAGYTGAATMGTCTT с помощью которых проведено секвенирование участка гена РНО видов F. poae, F. equiseti, F. acuminatum, F. tricinctum, F. torulosum (см. табл. 1). Расшифрованные последовательности были сравнены с депонированными в GenBank (табл. 2), что позволило выявить полиморфные участки, которые были использованы для подбора специфических праймеров.
Особое внимание было уделено сравнению последовательностей F. cerealis и близкородственных видов — F. culmorum, F. graminearum и F. pseudogramine
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.