ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 10, с. 1207-1211
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =
УДК 57.054:57.017.64
ГЕН hrs И ГРАНИЦЫ КОМПАРТМЕНТОВ ИМАГИНАЛЬНОГО КРЫЛОВОГО ДИСКА Drosophila melanogaster © 2015 г. Е. В. Мариловцева1, Л. В. Омельянчук1 2
Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук,
Новосибирск 630090 e-mail: ome@mcb.nsc.ru
2Новосибирский государственный университет, кафедра цитологии и генетики, Новосибирск 630090
Поступила в редакцию 09.12.2014 г.
Hrs (Hepatocyte growth factor receptor tyrosine kinase substrate) — белок эндосом, принимающий участие в сортировке и транспорте рецепторных тирозинкиназ и других белков, поглощенных клеткой при эндоцитозе, из ранних эндосом в лизосомы. Поскольку рецепторные тирозинкиназы являются важными компонентами различных сигнальных систем клетки, дефекты белка Hrs могут приводить к возникновению ряда аномалий развития. В частности было показано, что эктопическая экспрессия Hrs в почке крыла приводит к исчезновению одного или нескольких рядов маргинальных крыловых щетинок у имаго, что подразумевает участие гена hrs в регуляции формирования D/V границы диска. Ранее мы подтвердили участие Hrs в процессе формирования D/V границы имагинально-го крылового диска, а также показали изменение паттерна экспрессии гена apterous при эктопической экспрессии hrs. Настоящее сообщение посвящено уточнению и детализации влияния Hrs на D/V, а также на A/P границы компартментов имагинального крылового диска у Drosophila melanogaster.
Ключевые слова: имагинальный диск, компартмент, in situ гибридизация, D/V граница, A/P граница, Hrs. DOI: 10.7868/S0016675815100112
Белок ранних эндосом Hrs необходим для формирования D/V границы имагинального крылового диска. В норме морфоген Wg ассоциирует со своими рецепторами Frizzled и Arr на поверхности клетки с последующим переходом образовавшегося комплекса в ранние эндосомы. Находясь на поверхности эндосом, Frizzled и Arr способны ассоциировать с белком Dsh, тем самым усиливая сигнал Wg. Сила сигнала зависит от длительности пребывания комплекса на ранних эндосомах до его перехода во внутренние везикулы. Эктопическая экспрессия hrs в имагинальном крыловом диске личинок, несущих в генотипе систему 1096-Gal4—UAS-Hrs, приводила к небольшому увеличению ширины полосы экспрессии гена wg на D/V границе и ингибированию некоторых генов-мишеней Wg сигнального пути (в частности, Sence и Dll) [1]. В своей предыдущей работе [2] мы подтвердили факт участия белка Hrs в поддержании D/V границы имагинального крылового диска и дополнительно показали, что эктопическая экспрессии hrs в почке крыла также приводит к искажению паттерна экспрессии гена ap, активация которого является наиболее ранним событием в процессе закладывания и дальнейшего формирования D/V границы. На основе данного наблюдения мы сделали вывод, что "hrs также влияет на процесс формирования границы
на стадиях, предшествующих действию Wg. Механизм такого влияния, по-видимому, связан с процессом утилизации рецепторов сигнальных путей, отличных от Wg" [2]. В данной работе мы также показали, что эктопическая экспрессия hrs в почке крыла приводит к искажению паттерна экспрессии cut, гена-мишени сигнального пути Notch, принимающего участие в поддержании паттерна wg. В работе [3] было установлено, что благодаря своей способности предотвращать активацию рецептора Smoothened и, следовательно, супрессировать экспрессию ptc, гена-мишени Hh, Hrs также принимает участие в регуляции формирования и поддержания A/P границы има-гинального крылового диска. В настоящей работе мы показали, что эктопическая экспрессия hrs в почке крыла приводит не только к количественным, но и к качественным изменениям паттерна экспрессии ptc, что может быть обусловлено нарушением формирования градиента Hh либо иными причинами, требующими уточнения.
Линия w1118 P[wmW- hs = GawB}BxMS1096, несущая 1096-Gal4 драйвер, и линия, несущая GFP репортер w1118; P[w+mC = UAS-GFP.nls}8, были получены из Bloomington Drosophila Stock Center. Линия y w; P[w+ = UAS-hrs}12, содержащая конструкцию, кодирующую полноразмерный белок
1207
8*
1208
МАРИЛОВЦЕВА, ОМЕЛЬЯНЧУК
под контролем UAS промотора, любезно предоставлена H. Bellen (USA) [4].
Имагинальные крыловые диски выделяли из личинок 3-го возраста, фиксировали в 3.7%-ном формальдегиде на 1х фосфатном буфере (PBS, Phosphate buffer saline tablets, #P4417, "Sigma Ald-rich"), pH 7.2, промывали 3 раза по 10 мин в 1х PBS. Фиксированные ткани пермеабилизировали в буфере PBTriton (1% Triton X-100 в PBS) в течение 1 ч, обрабатывали 1%-ным блокирующим раствором сухого молока в PBTriton в течение 6 ч и инкубировали с первичными антителами (#2B10 (Drosophila Cut), Hybridoma Bank; #Apa1 (Droso-phila Patched), Hybridoma Bank) в 1х PBS (1 : 250). Имагинальные диски отмывали в 1х PBS 3 раза по 10 мин и инкубировали со вторичными антителами Alexa 488-conjugated goat anti-mouse IgG (#11001, Invitrogen) в 1х PBS (1 : 500) при 37°C в течение 1 ч. Диски отмывали в 1х PBS 2 раза по 10 мин, заключали в Mowiol и анализировали на флуоресцентном оптическом микроскопе Leica DM4000.
Фрагмент гена cut амплифицировали с использованием праймеров CAATAAGAAGCTGGG-TACCGCTG (5'-праймер) и CCAATAGTCGT-TGTCTAGATGCTCC (3'-праймер), содержащих сайты посадки эндонуклеаз KpnI и XbaI соответственно, и кДНК в качестве матрицы. Полученный фрагмент клонировали в вектор pGem (#0000111201, "Promega"). Плазмиду подвергали рестрикции эндонуклеазами KpnI или XbaI (для зондов antisense и sense соответственно) и очищали путем переосаждения в изопропаноле. Синтез зондов осуществляли с использованием полученной линеаризованной плазмиды в качестве матрицы и набора реактивов DIG RNA Labeling Mix (Sp6/T7) (#11277073910, "Roche") в соответствии с инструкцией, предоставленной производителем. Зонды гидролизовали в условиях повышенного рН при температуре 60°С с дальнейшей очисткой посредством переосаждения. Зонды использовали в рабочей концентрации 2 нг/мкл. Личинок 3-го возраста диссектировали в буфере DB (183 мМ KCl, 47 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl, pH 6.8) и фиксировали в буфере FB (4% формальдегид, 1 мМ ЭГТА) при 4°С в течение ночи. Отмывали последовательно 2 раза метанолом и 8 раз этанолом на льду. Проводили обработку смесью ксилола и этанола (1 : 1) (1 ч при комнатной температуре) с последующей отмывкой этанолом (5 раз) и метанолом (2 раза). Фиксировали повторно в 5%-ном растворе формальдегида в смеси метанола и PBTween (1 : 1) (1х PBS, 0.1% Tween-20) (5 мин), переносили диски в PBS, очищали от остатков кутикулы и фиксировали в 5%-ном растворе формальдегида в PBTween (30 мин при комнатной температуре(КГ)) с последующей отмывкой PBT (5 раз по 5 мин, КТ). Обрабатывали диски раствором протеиназы К (2.5 мкг/мл) в PBT в
течение 7—10 мин (в зависимости от количества дисков) при КТ, останавливали реакцию обработкой 2%-ным раствором глицина в PBTween на льду. Проводили отмывки PBTween (3 раза) и фиксировали в 5%-ном растворе формальдегида в PBTween при 4°C в течение ночи. На следующий день проводили отмывки PBTween (5 раз, КТ), 1 раз смесью PBTween и гибридизационного буфера HB (50% формамид, 5х SSC, 1х раствор Дэн-харта, 0.1% Tween-20, гепарин, тРНК, забивочная ДНК) (10 мин, 60°С) и 3 раза HB (60°С). Предги-бридизацию проводили в HB при 60°С в течение ночи. Зонд денатурировали и разводили в HB (конечная концентрация 2 нг/мкл); гибридизацию проводили при 60°С в течение 20 ч. Отмывали 4 раза по 30 мин HB при 60°С, удаляли формамид последовательными отмывками смесями HB и PBT (3 : 1, 1 : 1, 1 : 3), PBT (2 раза) и малеиновым буфером (MABT; 3 раза). Блокировали в 5%-ном растворе BSA в MABT (0.1 М Maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.5) в течение 40 мин (КТ) и обрабатывали раствором антител против дигоксигенина (#11093274980, Roche) в MABT (1 : 2000) при 4°С, в течение 16 ч. Отмывали 3 раза MABT, 3 раза щелочным буфером AB (100 мМ Tris-Cl, pH 9.5, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl2, 0.1% Tween-20), после чего обрабатывали раствором NBT (#R0841, "Thermo scientific") и BCIP (#R0841, "Thermo scientific") в AB до появления окраски. Проводили финальные отмывки PBT и заключали в Mowiol. Фотографии препаратов были сделаны на микроскопе Leica DM4000.
Процессы, происходящие на D/V границе имагинального крылового диска Drosophila melan-ogaster, представляют крайне высокий интерес для сообщества исследователей, занимающихся генетикой развития. Это обусловлено тем, что D/V граница формируется во втором личиночном возрасте, когда размеры дисков достаточно велики и, следовательно, легко идентифицируются, что дает возможность визуализировать происходящие в них процессы. Известно, что поддержание D/V границы в крыловом диске осуществляется преимущественно за счет координирования сигнальных путей Notch и Wg, причем Notch контролирует активность сигнального пути Wg благодаря своему непосредственному участию в активации экспрессии соответствующего морфогена. В частности, продукт гена-мишени Notch каскада cut играет важную роль в поддержании паттерна экспрессии wg. Так, в работе [5] была построена математическая модель процессов, происходящих на D/V границе имагинального крылового диска. Исходя из соображений устойчивости модели к внешним возмущениям, авторы сделали вывод, что роль гена сШ крайне важна и предположили, что продукт этого гена принимает непосредственное участие в ингибировании сигнального пути Wg. Далее авторы экспериментально проверили эту гипотезу модели и убедились в ее
ГЕН hrs И ГРАНИЦЫ КОМПАРТМЕНТОВ
1209
Рис. 1. Экспрессия гена cut в имагинальном крыловом диске. а, б, в — связывание антител к белку Cut у особей дикого типа, у особей, несущих драйвер1096^а14, и у особей, несущих систему 1096-Gal4—UAS-hrs (опыт). В позиции в стрелкой отмечено искажение полосы распределения Cut в почке крыла. г, д, е — in situ гибридизация cut РНК-зонда на внутриклеточную мРНК у особей дикого типа, у особей, несущих драйвер 1096-Gal4, и у особей, несущих систему 1096-Gal4—UAS-hrs (опыт). В позициях г, д белыми стрелками отмечены районы почки крыла, в котором
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.