ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 5, с. 326-332
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ
УДК 575.164
ГЕН NANA РЕГУЛИРУЕТ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК АПИКАЛЬНОЙ МЕРИСТЕМЫ ПОБЕГА ARABIDOPSIS THALIANA, НЕ ВЗАИМОДЕЙСТВУЯ С ГЕНАМИ CLV1, CLV2, CLV3 © 2014 г. А. В. Альберт*, У. Н. Кавай-оол**, Т. А. Ежова*
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва, ул. Ленинские Горы, ГСП1 **Тувинский государственный университет, 667000 Кызыл, ул. Ленина, 36 E-mail: ezhova2001@mail.ru Поступила в редакцию 10.02.14 г.
Окончательный вариант получен 04.03.14 г.
Постоянство пула стволовых клеток апикальной меристемы побега Arabidopsis thaliana обеспечивается системой генетической регуляции с отрицательной обратной связью, основанной на взаимодействии гена WUS, поддерживающего недетерминированность клеток, с генами CLV, ограничивающими уровень экспрессию гена WUS и размер пула стволовых клеток. Мутации clv приводит к увеличению пула стволовых клеток в апикальной и флоральной меристеме, а мутация wus — к противоположному эффекту. Мутация na (nana), также как и мутация wus, вызывает преждевременную терминацию функции апикальной меристемы побега, хотя не влияет на активность меристемы цветка. Для выяснения роли гена NA в контроле функционирования апикальной меристемы побега исследовано взаимодействие генов NA и CLV. Аддитивный фенотип двойных мутантов na clv1, na clv2-1 и na clv3-2 свидетельствует о том, что ген NA вносит независимый вклад в контроль функционирования апикальной меристемы побега. Предполагается, что ген NA осуществляет контроль пролиферации клеток апикальной меристемы побега при переходе растений на репродуктивную стадию развития, действуя значительно позже и независимо от системы генов WUS-CLV.
Ключевые слова: развитие побега, апикальная меристема, стволовые клетки, мутанты, Arabidopsis ШаНапа, генные взаимодействия.
DOI: 10.7868/S0475145014050024
ВВЕДЕНИЕ Развитие надземной части организма высших растений связано с функционированием апикальной меристемы (АМ) побега и содержащимся в ее центральной зоне пулом стволовых клеток Центральную роль в поддержании стволовости клеток АМ побега у модельного растения Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. играет ген WUSCHEL (WUS), экспрессирующийся в организующем центре АМ (Laux et al., 1996; Mayer et al., 1998). Продукт гена WUS перемещается в вышележащие клетки, поддерживая их недетерминированный статус (состояние стволовости). Кроме того, ген WUS индуцирует экспрессию гена CLAVATA3 (CLV3), связываясь с его промотором (Yadav et al., 2011).
CLV3 кодирует небольшой секреторный белок, связывающийся с рецепторной киназой CLV1 и рецептор-подобным белком CLV2, по принципу лиганд-рецептор (Clark et al., 1997; Fletcher et al., 1999). Помимо этого белок CLV3 способен фор-
мировать лиганд-рецепторные комплексы с CLV2 и рецепторной киназой CRN (Muller et al., 2008) без участия CLV1, а также с рецептор-подобной киназой RPK2/TOAD2 (Kinoshita et al., 2010). Рецептор-подобная киназа CRN также необходима для образования комплекса CLV1 и CLV2 (Zhu etal., 2010; Bleckmann et al., 2010). Три образующихся трансмембранных комплекса действуют независимо друг от друга и оказывают репрессирующее влияние на WUS. Система генетической регуляции WUS-CLV с отрицательной обратной связью способна быстро компенсировать значительные колебания в уровнях экспрессии ее компонентов и оказывать влияние на пролиферацию клеток АМ побега (Reddy, Meyerowitz, 2005; Muller et al., 2006; Yadav et al., 2010).
Помимо генов системы WUS-CLVвыявлен целый ряд дополнительных компонентов, большинство из которых модулируют экспрессию этих центральных регуляторов пула стволовых клеток (Альберт, Ежова, 2013; Barton, 2010; Yadav
й а1., 2013). Тем не менее, существующая картина генетической регуляции далека от завершения. Так, например, нет информации о генетической регуляции тех структурных и динамических преобразований АМ, которые наблюдаются у самых разных видов растений при переходе на репродуктивную стадию развития. Важнейшими из этих преобразований, необходимых для успешной репродукции, являются следующие: АМ цветоноса увеличивается в объеме по сравнению с вегетативной, а клетки центральной зоны (стволовые клетки) приступают к активным делениям, хотя в вегетативном апексе они делятся редко, как и положено стволовым клеткам (Kwiatkowska, 2008). Для выявления генов, контролирующих эти преобразования АМ побега, необходимо исследовать мутанты с новыми морфологическими особенностями.
Полудоминантная карликовая мутация nana (na) Л. thaliana из коллекции кафедры генетики МГУ им. М.В. Ломоносова вызывает формирование укороченного цветоноса (у гетерозигот — в 8— 13 раз в сравнении с диким типом) за счет сокращения длины междоузлий и уменьшения числа узлов. Укорочение междоузлий мутанта па связано с уменьшением размера клеток (Ежова и др., 2002; Лебедева и др., 2005) и не восстанавливается под действием экзогенного гиббереллина (Ежова и др., 1997, 2002). В АМ цветоноса мутантов па уменьшения размеров клеток относительно дикого типа не наблюдается. Тем не менее, размер АМ гетерозиготных растений па в 2—3 раза меньше, чем у растений дикого типа (Ежова и др., 2002), что свидетельствует об участии гена ЫЛ в регуляции размера пула стволовых клеток или пролиферативной активности клеток АМ побега. Для того, чтобы выяснить, действует ли ген ЫЛ на эти процессы, влияя на систему ШиБ—СЬУ, необходимо изучить взаимодействие гена ЫЛ с ранее исследованными генами. Целью данной работы является анализ возможных взаимодействий гена ЫЛ с генами С1У1, С1У2 и СЬУЗ с помощью изучения особенностей развития и структуры АМ побега растений двойных мутантов па с1у1, па с1у2-1, па с1уЗ-2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы мутанты Л. ЛаНапа из коллекции кафедры генетики МГУ — па (линия К-164), с1у1 (линия К-205) и ЛБЯС - с1у2-1 ^46) и с1уЗ-2 (CS8066). Гетерозиготные растения мутанта па, прошедшего 3 возвратных скрещивания с родительской расой ЕпкИет-М (линия К-2), скрещивали с гомозиготными мутантами с1у и в Р2-Р4 отбирали растения, которые были гомозиготами по мутациям с1у и гомо- и гетерозиготными по мутации па. Для удаления эффекта генетического фона двойные мутанты па с1у1 и па с1у2-1
возвратно скрещивали с мутантом na и в F2—F3 вновь отбирали двойных мутантов. Поскольку мутация clv3-2 (CS8066) была получена на основе линии Ler, содержащей мутацию er, тесно сцепленную с clv3-2, двойной мутант na clv3-2 всегда был гомозиготен по er (по сути, представлял собой тройной мутант). В связи с этим для корректного сравнения с двойным мутантом na clv3-2 использовали растений мутанта na, с мутацией er, выделенные из F2 от скрещивания na с линией Ler. Для анализа морфологии растения выращивали в смеси почвы и песка (2 : 1) в условиях теплицы на длинном дне (16 ч свет/8 ч темнота). Для анализа вегетативных АМ растения выращивали в стерильных условиях на чашках Петри.
Съемки растений проводили цифровым фотоаппаратом "Canon" (Япония) под бинокуляром Stemi 2000-C (Германия). Детальный анализ структуры органов проводили с помощью сканирующих электронных микроскопов JSM-6380LA и СЭМ S-405A (фирм Jeol и Hitachi, Япония, соответственно).
Апикальные меристемы для СЭМ выделяли из растений на стадии образования вторых взрослых листьев и на стадии начала цветения. Образцы инкубировали в растворе 70% этанола 16 ч при 4°С. Далее образцы переносили последовательно в растворы этанола 80% — 10 мин, и дважды 95% этанола — по 30 мин. Далее образцы инкубировали в смеси этанол 96% : ацетон 50% (1 : 1) в течение 30 мин и в 100% ацетоне в течение 2-х ч. Высушенные образцы прикрепляли к металлическим столикам, напыляли смесью палладия и платины в ионном напылителе IB-3 ("Eiko", Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ морфологии побега двойных мутантов
Взрослые растения двойных мутантов na clvl, na clv2-1 и na clv3-2, как и растения одиночного мутанта na являются карликами. У растений clvl, clv2-1 и clv3-2, гетерозиготных по мутации na, помимо укороченного главного цветоноса, высота которого не превышала 4 см, формировались многочисленные розеточные побеги, которые придавали растениям кустообразную форму (рис. 1а). Урастений clvl, clv2-1 и clv3-2, гетерозиготных по мутации na, на главном цветоносе образовывалось от 3 до 7 цветков, после чего побег прекращал развитие. Отметим, что ни у родительских форм, ни у двойных мутантов образования терминальных цветков не наблюдалось (рис. 1б—1г), т.е. терминация развития цветоноса связана не с преобразованием апикальной меристемы побега во флоральную, а с прекращением ее активности.
У растений clv3-2, гетерозиготных по мутации na, на главном цветоносе иногда образовывалось до 15 цветков. Это не было связано с увеличением высоты цветоноса, но объяснялось ярко выра-
Рис. 1. Особенности морфологии двойных мутантов па с1у1, па с1у2-1 и па с1уЗ-2: (а) — общий вид растений (слева—направо) одиночного мутанта с1у1, гетерозиготы па и двойного мутанта с1у1, гетерозиготного по мутации па; (б-г) — главные цветоносы мутантов с1у1, с1у2-1 и с1уЗ-2, соответственно, гетерозиготных по мутации па (стрелки указывают на апексы); (д) — сканирующая электронная микросопия фасциированного цветоноса с1уЗ-2, гетерозиготного по мутации па; (е—з) — стручки двойных мутантов па с1у1, па с1у2-1 и па с1уЗ-2, соответственно (1 — па, 2 — двойной мутант, 3 — с1у).
женной фасциацией стебля (рис. 1г, 1д), которая является характерной особенностью одиночных мутантов clv3 (Clark et al., 1995).
У одиночного мутанта na изменения строения цветка и формы стручка по сравнению с диким типом мы практически не наблюдали. У всех двойных мутантов увеличивалось число плодолистиков в стручке (рис. 1е—1з), что характерно для мутантов clvl, clv2 и clv3 (Clark et al., 1993, 1995; Kayes, Clark, 1998).
Гомозиготные двойные мутанты na clvl, na clv2-1 и na clv3-2 обычно не зацветали, как и одиночные гомозиготы na. Редкое появление цветков у ~5% гомозиготных растений na clv1, naclv2-1 и ~10% na clv3-2 все же было возможно благодаря развитию цветоносов в пазухах розе-точных листьев. Причем, длина таких
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.