УДК 597.553.2.575.17
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ГОЛЬЦОВ (РОД SALVELINUS) ИЗ ОЗЕРА КРОНОЦКОЕ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК © 2012 г. А. Л. Сенчукова, С. Д. Павлов, М. Н. Мельникова, Н. С. Мюге***
Московский государственный университет *Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии — ВНИРО, Москва **Институт биологии развития РАН — ИБР РАН, Москва E-mail: asenchukova@gmail.com Поступила в редакцию 24.11.2011 г.
Определена последовательность участка D-loop митохондриальной ДНК длиной 558 п.н. для 224 экз. и последовательность гена цитохрома b длиной 1015 п.н. для 212 образцов гольцов (род Salvelinus) озёрно-речной системы Кроноцкое. На объединённой последовательности длиной 1573 п.н. (1—558 п.н. D-loop и 559—1573 п.н. цитохрома b) выявлены 39 вариабельных сайтов и 43 разных гаплотипа. Проведена оценка применимости вариабельности митохондриального генома для дифференциации симпатрично обитающих разных форм гольцов озёрно-речной системы Кроноцкое.
Ключевые слова: Salvelinus malma, митохондриальная ДНК, микроэволюция, видообразование.
Кроноцкое озеро — самый большой пресноводный водоём Камчатки. Оно расположено на территории Кроноцкого заповедника, благодаря чему сохранило свою природную экосистему и представляет значительный научный интерес.
Ихтиофауна озера долгое время формировалась в условиях изоляции, в видовом отношении небогата. Здесь обитают жилая форма нерки Оп-согНупскт пвгка — кокани и гольцы (род БаЬеЫ-пт). Гольцы образуют в оз. Кроноцкое сложную популяционную структуру и представляют большой интерес для изучения процессов формообразования и механизмов микроэволюции (Викторов-ский, 1978; Савваитова, 1989; Салменкова и др., 2005; Радченко и др., 2006; ОбЛю^ й а1., 2009).
По мнению разных авторов, в озере обитают от трёх до пяти разных форм гольцов (Викторов-ский, 1978; Савваитова, 1989; Глубоковский, 1995; Черешнев и др., 2002; Павлов и др., 2003, 2012). Выделяют носатого (голец Шмидта), длинноголового, белого гольцов, речную мальму и карликового гольца. Таксономический статус гольцов Кроноцкого озера до сих пор остаётся дискуссионным.
Генетические исследования гольцов из оз. Кро-ноцкое начаты сравнительно недавно (Салменко-ва и др., 2005; Радченко и др., 2006; 08Лег§ е! а1., 2009; Павлов и др., 2012). Выявлено, что на фоне общей генетической неоднородности и различного уровня обособленности форм по маркёрам ядерной ДНК данных об изменчивости митохон-дриального генома у гольцов из этого водоёма всё
ещё недостаточно, чтобы судить об их происхождении и дивергенции друг от друга.
Цель нашей работы — дифференциация форм гольцов озёрно-речной системы Кроноцкое на основе анализа вариабельности участка Б-1оор и гена цитохрома Ь (Су? Ь) митохондриальной ДНК (мтДНК).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материал собран сотрудниками кафедры ихтиологии МГУ в 2003, 2004 и 2010 гг. Для генетического анализа отобраны гольцы пяти разных форм: носатый, белый, карликовый гольцы, речная мальма (из притоков озера) и длинноголовый голец. Выборки некоторых форм были собраны в разных локальностях озера, но, учитывая цели и задачи работы, а также ограниченность материала, были объединены в пределах одной формы. Выборки носатого и длинноголового гольцов представлены сборами 2003 и 2010 гг. В качестве аутгруппы использовали выборки проходной мальмы 8а1уеИпы8 та1та из р. Кроноцкая сборов 2004 и 2010 гг. Места сбора выборок и их обозначения приводятся на рис. 1 и в табл. 1.
Всего исследовали 239 экз. гольцов, после се-квенирования нечитаемые последовательности были исключены из анализа. Для участка Б-1оор получено 224 последовательности ДНК, для Су? Ь — 212. Статистической обработке результатов были подвергнуты образцы, которые имели обе последовательности (Б-1оор и Су? Ь), — всего 196 экз.
Рис. 1. Места сбора материала; 1—13 — номера выборок (см. в табл. 1).
ДНК выделяли стандартным солевым методом (Aljanabi, Martinez, 1997). Реакцию амплификации проводили в объёме 15 мкл: 1.5 мкл 10х ПЦР-буфер (Sileks, Россия), 2.5 мМ MgCl2, 0.6 мМ dNTP, по 2 пМ каждого праймера, 100 нг ДНК и 1 единицу Hot Taq ДНК-полимеразы (Sileks). Для амплификации участка D-loop мтДНК использовали олигонуклеотидные праймеры HN20 GTGT-TATGCTTTAGTTAAGC и Tpro2 ACCCTTA-ACTCCCAAAGC (Brunner et al., 2001), для амплификации гена Cyt b — праймеры L14795 TAATG-GCCAACCTCCGAAAA и H15844 AGCTAC-TAGGGCAGGCTCATT (Радченко, 2003). Для се-квенирования участка D-loop использовали праймер Tpro2, для секвенирования гена Cyt b — оба праймера (L14795 и H15844). Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе ABI 3100 с использованием набора для секвенирования BigDye v.1.1.
Обработку продуктов секвенирования и множественное выравнивание осуществляли в пакете программы DNAStar (Lasergene Inc.). Для представления филогенетических отношений между гаплотипами использовали метод максимальной
экономии (Templeton et al., 1992), реализованный в программе TCS (Clement et al., 2000); статистический и филогенетический анализы проводили в программах Mega 5.05 (Tamura et al., 2011) и Arlequin 3.5 (Excoffier, Lischer, 2010).
Для сравнительного анализа по гену Cyt b кро-ноцких гольцов и выборок из разных популяций северной мальмы использовали данные GenBank. Сравнительный материал включает следующие выборки гольцов из ранее опубликованных работ (Радченко, 2004; Радченко и др., 2006): выборка разных форм гольцов из оз. Кроноцкое, 2003 г. (носатый голец: DQ298792, DQ298788; длинноголовый голец: DQ298803, DQ298798, DQ298797, DQ298805, DQ298793; белый голец: DQ298802, DQ298789, DQ298790, DQ298791; проходная мальма из р. Кроноцкая: DQ298804, DQ298794); а также выборки гольцов Камчатки (DQ298801), Чукотки (DQ298796, DQ298799, AY286028, DQ298800, DQ298806, AY286036, AY286037, AY286039), Охото-морья (AY286029, DQ298795, AY286034), Таймыра (AY286023, AY286024, AY286025), Финляндии (AY286021), Забайкалья (AY286026), бассейна р. Колыма (AY286040, AY286041, AY286043,
Таблица 1. Выборки и формы гольцов рода БаЬеНпш, включенные в исследование
Выборки Форма (год сбора) Место сбора Число образцов Исследованные участки мтДНК
В-\оор Суг Ь В-\оор и Суг Ь
1 Носатый голец (2003) оз. Кроноцкое 28 27 25 24
2 Носатый голец (2010) То же 22 21 18 17
3 Белый голец (2003) » 57 51 51 45
4 Карликовый голец (2003) » 4 4 4 4
5 Речная мальма (2003) » 37 32 33 28
6 Длинноголовый голец (2003) » 14 13 14 13
7 Длинноголовый голец (2010) » 9 8 9 8
8 Проходная мальма (2010) р. Кроноцкая 39 39 34 30
9 Проходная мальма (2004) То же 29 29 24 24
Всего 239 224 212 196
10* Носатый голец (2003) оз. Кроноцкое 2
11* Белый голец (2003) То же 4
12* Длинноголовый голец (2003) » 5
13* Проходная мальма (2003) р. Кроноцкая 2
Примечание: * даны по: Радченко и др., 2006.
AY286044). В качестве реперного вида был использован образец кунджи Б. ¡еисотаетз (AY286045).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определена последовательность контрольного региона (Б-1оор) мтДНК длиной 558 п.н. для 224 экз. и последовательность гена Суг Ь длиной 1015 п.н. для 212 образцов гольцов озёрно-речной системы Кроноцкое. Последовательности нуклеотидов, полученные в данной работе, депонированы в GenBank (Ж868278-Ж868713).
На участке Б-1оор мтДНК выявлены восемь вариабельных сайтов (1.4% от всех сайтов) и 11 разных гаплотипов. Частота нуклеотидов: А = = 30.95%, Т = 31.91%, С = 20.96% и G = 16.19%: трансверсии на участке Б-1оор мт ДНК не обнаружены.
На участке митохондриального гена Суг Ь выявлены 32 вариабельных сайта (3% от всех сайтов) и 33 разных гаплотипа. Частота нуклеотидов: А = = 24.08%, G = 15.81%, Т = 29.08%, С = 31.03%; соотношение транзиций к трансверсиям — 3.78.
В общий филогенетический анализ вошли только образцы 196 экз., имеющие обе последовательности — Б-1оор и Суг Ь. По объединённой последовательности длиной 1573 п.н. (1—558 п.н. Б-1оор и 559—1573 п.н. Суг Ь) выявлены 39 вариабельных сайтов и 43 разных гаплотипа (табл. 2, 3).
При сравнении выборок одной формы, собранных в разные годы, по /^критерию небольшие, но достоверные различия обнаружили носа-
тый голец (0.18807, р < 0.01) и проходная мальма (0.08516, р < 0.01). Для проходной мальмы эти различия можно объяснить гетерогенностью выборок, взятых в разные годы, что характерно для анадромных рыб с высоким хомингом. Что касается носатого гольца, то эти различия обусловлены, главным образом, присутствием гаплотипа Н2 (9 экз. из 27) в выборке 2003 г. при отсутствии этого гаплотипа в выборке 2010 г. Следует отметить, что в 2003 г. подавляющее число рыб с этим гаплотипом было отловлено в районе р. Лиственничная (7 особей из 9), а в 2010 г. сборы в этом районе не проводили. Таким образом, различия между выборками по гаплотипу Н2 скорее всего обусловлены разными районами вылова и возможной гетерогенностью распределения гапло-типов внутри озера. В то же время высокий показатель встречаемости гаплотипов Н11 и Н39 в обеих выборках свидетельствует о генетическом сходстве рыб, выловленных в разные годы.
Для выборок, представляющих все анализируемые формы, уровень попарной межвыборочной дифференциации в величинах варьирует от 0.00425 до 0.46268 (табл. 4). Наибольший уровень отличий (0.46268) наблюдается между длинноголовым и карликовым гольцами, наименьший (0.00425) — между речной мальмой и носатым гольцом. Отличия по между белым и носатым гольцами, а также отличия длинноголового гольца и проходной мальмы от других популяций показывают высокий уровень достоверности (р < < 0.01). Общий уровень дифференциации среди
Таблица 2. Вариабельные сайты в объединённой последовательности (1—558 п.н. Б-Ьор, 559—1573 п.н. Су? Ь) у разных форм гольцов рода БаЬеНпт ] озёрно-речной системы Кроноцкое
чо ы
И
О
я
ч о о Е К
Я
К о й о м
к
К
£
Гап-
лотипы
Н1
Н2
НЗ
Н4
Н5
Н6
Н7
Н8
Н9
НЮ
Н11
Н12
Н13
Н14
Н15
Н16
Н17
Н18
Н19
Н20
Н21
Н22
Н23
Н24
Н25
Н26
Номер позиции в объединённом выравнивании участка В-1оор и гена Су? Ь
С
О
О
о
о
о
о
о
о
о
с
о
о
о
о
с
о
с
о
о
о
с
о
о
о
о
с
о
о
с
о
с
с
с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.