ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 7, с. 792-798
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 638.12:631.523.5
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ЛОКАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ТЕМНОЙ ЛЕСНОЙ ПЧЕЛЫ Apis mellifera mellifera L. НА УРАЛЕ
© 2015 г. Р. А. Ильясов1, А. В. Поскряков1, А. В. Петухов2, А. Г. Николенко1
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа 450054
e-mail: apismell@hotmail.com 2Пермский государственный гуманитарно-педагогический университет, кафедра зоологии, Пермь 614990
Поступила в редакцию 08.08.2014 г.
В течение последних двух веков пчеловоды в России и европейских странах завозили пчел из южных регионов в северные, в результате чего генофонд темной лесной пчелы подвида Apis mellifera mellifera L. был подвержен значительной гибридизации. Для уточнения на генетическом уровне ранее опубликованных в литературе морфологических данных по аборигенной популяции пчел на Урале, в Республике Башкортостан и Пермском крае нами проведен анализ полиморфизма маркеров мито-хондриальной (межгенный локус COI-COII мтДНК) и ядерной (два микросателлитных локуса, ap243 и 4a110) ДНК. Выделены четыре сохранившиеся локальные популяции темной лесной пчелы A. m. mellifera на Урале и получены их основные генетические характеристики. Данные о генетической структуре и географической локализации ареалов локальных популяций темной лесной пчелы на Урале могут быть полезны при восстановлении нарушенного генофонда A. m. mellifera в России и других северных странах.
DOI: 10.7868/S0016675815070048
Естественный ареал медоносной пчелы Apis mellifera Linnaeus 1758 [1] включает Европу, Африку и Западную Азию [2, 3]. Вид подразделяется на 29 подвидов, которые группируются в четыре эволюционные ветви [4—6]: африканская ветвь (A), ближневосточная ветвь (O) и две европейские ветви (C и M) [3, 7—10]. Исследования митохон-дриальной и ядерной ДНК (по микросателлит-ным локусам) также подтвердили данные по мор-фометрии о подразделении подвидов пчел на четыре эволюционные ветви [5, 11, 12].
Из 29 подвидов пчел только один Apis mellifera mellifera Linnaeus 1758 [1], называемый в мире темной европейской, а в России темной лесной, или среднерусской пчелой, имеет огромный ареал распространения вдоль всей Северной Евразии, покрытой лесной и лесостепной растительностью. Подвид медоносной пчелы A. m. mellifera уникально адаптирован к экстремально холодным и продолжительным зимам и болезням долгих зимовок, таким как нозематоз, а также к сбору годового запаса меда в короткий период бурного цветения липы в условиях резко континентального климата Евразии [13].
За последние два века ареал A. m. mellifera существенно сократился вследствие интенсивных вырубок лесов, интродукции на северные территории южных подвидов пчел, распространения новых патогенов, как нозематоз типа С, вызываемый микроспоридией Nosema ceranae [14], варро-атоз и аскосфероз. Многочисленные экспери-
менты по скрещиванию разных подвидов медоносной пчелы в условиях одной пасеки привели к бесконтрольной гибридизации подвидов во всем ареале [13, 15, 16]. В коммерческом пчеловодстве Европы и России на данный момент преобладают интродуцированные в Северную Евразию южные подвиды, такие как А. т. \igustica [17], А. т. еагтеа [18], А. т. caucasica [19], А. т. еаграИса [20] и А. т. агтвтаса [21].
Вследствие гибридизации и неограниченного потока генов между естественными и коммерческими популяциями пчел [12, 22] генофонд аборигенных темных лесных пчел А. т. твШ/вга считают утраченным во многих странах Европы [15]. Так, в Германии в результате массовой интродукции южных пчел произошла полная замена подвида А. т. твШ/вга подвидом А. т. сатюа [23, 24]. В России подвид А. т. твШ/вга был практически повсеместно заменен подвидами А. т. caucasica и А. т. caгpatica [13, 16]. В скандинавских странах и на Британских островах большинство пчеловодов предпочитают разводить А. т. \igustica, А. т. caгni-ca или искусственно выведенную породу бэкфаст [15]. Таким образом, в последние несколько десятков лет естественный ареал А. т. твШ/вга значительно сократился во всех странах Евразии.
Однако по ранее опубликованным морфологическим исследованиям пчел на территории Пермского края и республики Башкортостан можно предположить, что генофонд темной лесной пчелы А. т. твШ/вга еще не полностью утра-
чен в России [13, 16, 25—27]. Согласно морфометри-ческим данным, в настоящее время пчеловодство России имеет достаточные для восстановления генофонда A. m. mellifera ресурсы, сохранившиеся на территории республик Башкортостан, Татарстан и Удмуртия, Алтайского и Пермского краев и Кировской области [16, 26, 27].
В России ежегодно происходит уменьшение продуктивности пчелиных семей и их массовая гибель после зимовки, что является результатом снижения адаптированности к условиям среды обитания вследствие гибридизации с южными подвидами [13, 26, 27]. Бурзянская популяция темной лесной пчелы A. m. mellifera сохраняется в основном благодаря усилиям сотрудников заповедника "Шульган-Таш" и географической изоляции горно-лесными массивами уральских хребтов [13, 16, 28]. В России до сих пор не отработаны правовые механизмы сохранения генофонда местных пчел. Каждая сохранившаяся популяция темной лесной пчелы A. m. mellifera в России находится под постоянной угрозой исчезновения в результате гибридизации с интродуци-рованными подвидами пчел [27—29].
Для восстановления аборигенного генофонда медоносной пчелы A. m. mellifera на Урале необходима точная идентификация подвидов. До недавнего времени в России для этих целей использовались только морфометрические методы [13, 26]. Несмотря на то, что морфометрические признаки являются важными при классификации пчел, их трудно использовать для идентификации подвидов, поскольку они сильно подвержены влиянию условий среды обитания и естественного отбора [6]. Генетический маркер, такой как межгенный локус COI-COII мтДНК, уникальный для рода Apis, является самым информативным в исследованиях пчел [30]. Вариабельность длины нуклео-тидной последовательности этого локуса используется для дифференцировки подвидов четырех эволюционных ветвей и идентификации темной лесной пчелы A. m. mellifera [4, 31, 32].
Разработанный нами метод дифференциации подвида A. m. mellifera от подвидов A. m. caucasica и A. m. carnica эволюционной ветви С позволяет исследовать сохранившийся генофонд темной лесной пчелы на территории республики Башкортостан и Пермского края. Метод основан на четких различиях вариантов локуса COI-COII мтДНК у представителей эволюционных ветвей М и С, где варианты PQ, PQQ и PQQQ встречаются только у подвида A. m. mellifera (эволюционная ветвь М), а Q — только у интродуцированных из южных регионов подвидов (эволюционная ветвь С) [4]. Этот метод был модифицирован сотрудниками Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и позволил амплифициро-вать фрагменты ДНК пчел на 200 пн короче, чем
в работах европейских исследователей, что ускоряет и упрощает анализ пчел [13, 26].
Микросателлитные локусы также являются уникальными маркерами для изучения популя-ционно-генетической структуры и уровня гибридизации подвидов пчел [30, 33, 34]. Наши исследования в основном ориентированы на изучение популяции пчел A. m. mellifera республики Башкортостан и Пермского края. Некоторые локальные популяции пчел на Урале подвержены гибридизации с подвидами эволюционной ветви С — A. m. caucasica и A. m. carpatica. Цель нашего исследования — получить сведения о генетической структуре и ареале популяции темной лесной пчелы A. m. mellifera на Урале, подразделенной на несколько локальных популяций, на основе изучения полиморфизма митохондриального (COI-COII) и двухъядерных (микросателлиты ap243 и 4a110) локусов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для исследования были отобраны образцы рабочих пчел из 11 пасек трех районов республики Башкортостан и 11 пасек семи районов Пермского края (всего 550 семей) (рис. 1). Образцы пчел были законсервированы в 96%-ном этаноле.
Тотальная ДНК была выделена из грудных мышц методом экстракции на основе смеси гуа-нидинтиоцианат—фенол—хлороформ [35]. ПЦР локуса COI-COII мтДНК была выполнена по ранее опубликованному методу [13, 26]. Статистическую обработку проводили с использованием программ FSTAT 2.9.3.2 и Genepop 4.2.2. Дендро-грамма была построена с применением программы STATISTICA 8.0.
Межгенный локус COI-COII мтДНК, расположенный между 3'-концом гена COI и 5'-концом гена COII, был амплифицирован с помощью ло-кус-специфичных олигонуклеотидных прайме -ров F-Nik: САСАТТТАGAAATTCCATГA и R-Nik: ATAAATATAAATCATGTGGA, в модифицированных условиях, описанных Никоноровым и соавт. [26], позволяющих получать более короткие ам-плифицированные фрагменты ДНК — на 200 пн короче разработанных ранее европейскими исследователями [26].
У медоносной пчелы подвида A. m. mellifera эволюционной ветви М амплифицируются фрагменты PQ размером 400 пн, PQQ размером 600 пн и PQQQ размером 800 пн, а у южных подвидов эволюционной ветви С — только фрагмент Q размером 300 пн (рис. 2) [13, 26]. Такой уникальный полиморфизм длин межгенного локуса COI-COII мтДНК служит маркером для четкой дифференциации местных и интродуцированных подвидов пчел в условиях России.
794
ИЛЬЯСОВ и др.
Рис. 1. Схема расположения изученных локальных популяций медоносной пчелы A. mellifera.
Два микросателлитных локуса, 4a110 и ap243, ранее описанные для A. mellifera [36, 37], были использованы в исследовании генетической структуры темной лесной пчелы подвида A. m. mellifera на Урале. ПЦР была выполнена в объеме 15 мкл, содержащем 50—200 нМ каждого праймера, 100 мкМ каждого dNTP, 1.2-1.5 мМ MgCl2, 1х буфер (10 мМ Tris-HCl, pH 8.3, 50 мМ KCl), 0.5 U Taq-полимеразы (Sintol) и 2 мкл экстракта ДНК. Условия ПЦР: начальная денатурация 3 мин при 94°C, 30 циклов с денатурацией 30 с при 94°C, отжигом 30 с при 55°C и элонгацией 30 с при 72°C и завершающей элонгацией 5 мин при 72°C. Фрагментарный анализ продуктов ПЦР был выполнен на автоматическом секвенаторе Applied Biosystem Sequencer. В изученных нами локальных популяциях темной лесной пчелы A. m.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.