УДК 597.553.2.575.174
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИВЕРГЕНЦИЯ ПОПУЛЯЦИЙ БЕЛОГО ГОЛЬЦА SALVELINUS ALBUS, СЕВЕРНОЙ И ЮЖНОЙ ФОРМ МАЛЬМЫ S. MALMA (SALMONIDAE) ПО МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ ЛОКУСАМ ДНК
© 2009 г. Е. А. Салменкова*, В. Т. Омельченко**, К. И. Афанасьев*, Г. А. Рубцова*, М. Ю. Ковалев**
* Институт общей генетики РАН — ИОГен РАН, Москва ** Институт биологии моря Дальневосточного отделения РАН — ИБМ, Владивосток
* E-mail: salm@vigg.ru Поступила в редакцию 26.01.2009 г.
Между симпатрическими популяциями северной мальмы Salvelinus malma malma и белого гольца S. albus на основе анализа 9 микросателлитных локусов выявлена очень небольшая, но статистически значимая генетическая дифференциация по аллельным частотам (в бассейне р. Камчатка FST = = 0.016 и в оз. Кроноцкое FST = 0.063). Факторный анализ и кластеризация индивидуальных много-локусных генотипов в суммарной выборке симпатрических S. malma malma и S. albus также показывают их крайне слабую генетическую дифференциацию. Дивергенция между географически изолированными (аллопатрическими) популяциями у каждого из этих гольцов в 2—3 раза превышает межвидовую дифференциацию в зонах симпатрии; выборки из аллопатрических популяций кластеризуются по географическому, а не по таксономическому принципу. Вероятно, такая ситуация может быть обусловлена отсутствием репродуктивной изоляции и наличием гибридизации между симпатрическими S. malma malma и S. albus c одновременным существованием некоторых ограничений генетического обмена, связанных с экологической специализацией этих гольцов. Анализ микросателлитных локусов выявил очень значительные генетические различия между северной и южной формами мальмы S. malma krascheninnikovi, многократно превышающие генетические различия между S. malma malma и S. albus. Полученные данные не подтверждают самостоятельного видового статуса S. albus, но поддерживают мнение о видовом уровне различий северной и южной форм мальмы.
Ключевые слова: микросателлитная ДНК, генетическая дифференциация, Salvelinus malma malma, S. albus, S. malma krascheninnikovi.
Согласно современным представлениям, гольцы рода Salvelinus в бассейне нижнего течения р. Камчатка (в том числе в оз. Азабачье, соединяющемся с рекой протокой Азабачья) представлены 3 массовыми видами — северной формой мальмы S. malma malma, белым гольцом S. albus и кунджей S. leucomaenis (Глубоковский, 1977а, 1977б, 1995; Черешнев и др., 2002; Богуцкая, Насека, 2004). Если валидность вида S. leucomaenis не вызывает сомнений, то относительно таксономического статуса белого гольца мнения ихтиологов расходятся. Впервые белый голец был описан Викторовским (1975, 1978) как одна из внутривидовых форм, или локальных популяций мальмы, обитающих в бассейне оз. Кроноцкое (п-ов Камчатка). Позднее Глубоковский (1977б, 1995) идентифицировал эту форму с описанным им ранее в бассейне р. Камчатка видом S. albus, указав, что белый голец надежно дифференцируется от мальмы только по особенностям анатомии черепа, или краниологическим признакам. Черешнев с соавторами (2002) в своей сводке так-
же представили белого гольца как самостоятельный вид. С другой стороны, мнение о видовой самостоятельности белого гольца рядом ихтиологов подвергается сомнению (Савваитова, 1989; Решетников и др., 1997; Решетников, 1998).
В такой ситуации необходимы сведения о степени репродуктивной изоляции S. albus от S. mal-ma malma в условиях характерного для них сим-патрического обитания. Такого рода информацию можно получить путем анализа различных молекулярно-генетических маркеров у соответствующих гольцов. Выявление мономорфных (фиксированных) видоспецифичных маркеров у симпатрических форм/видов однозначно свидетельствует об отсутствии между ними обмена генами, или об их репродуктивной изоляции. Исследования аллозимных маркеров в выборках мальмы и белого гольца из бассейна оз. Азабачье не позволили четко их дифференцировать: не было найдено видоспецифичных фиксированных аллелей (Ефремов, 1991; Osinov, 1999; наши не-
Таблица 1. Характеристика исследованных микросателлитных локусов
Локус Повторяющаяся последовательность Температура отжига, °С Интервал аллельных размеров Источник информации
Smm3 (CA)nCG(CA)n 50 114-126 &ane et al., 2004
Smm5 (CA)nC(CA)n 51 92-94 »
Smm10 (TCCA)n 53 146-250 »
Smm21 (TC)nTTTC(TC)n 54 113-137 »
Smm22 (TAGA)n 50 120-272 »
Ssa197 (GT)nC(TG)nTC(TG)nA(GTGA)n 52 114-170 O'Reilly et al., 1996
SSOSL456 (AC)nAG(AC)n 58 156-192 Slettan et al., 1997
Omy301 (CA)n 50 62-78 Estoup et al., 1993
Ogo1a (GTCT)n 54 138-150 Olsen et al., 1998
опубликованные данные). Не обнаружилось отличий между этими гольцами и по гаплотипическо-му составу сегмента мтДНК (D-loop + ген cyt b) (Salmenkova et al., 2000), а также при анализе гап-лотипического состава митохондриального генома с использованием значительно большего числа рестриктаз (Олейник, Полякова, 1994) и анализе рибосомальной ДНК (Phillips et al., 1995). В предшествующем исследовании мальмы и белого гольца, обитающих в бассейне Кроноцкого озера (Салменкова и др., 2005; Радченко и др., 2006), между ними также не выявлены фиксированные различия ни по аллозимным маркерам, ни по электрофоретическим спектрам миогенов, не обнаружена дифференциация по частотам гап-лотипов сегмента мтДНК (ATPase6/ND4L) и по нуклеотидной последовательности гена cyt b, но были найдены достоверные различия по аллель-ным частотам аллозимных и микросателлитных локусов.
В настоящей работе предпринят анализ степени генетической дифференциации и репродуктивной изоляции между мальмой и белым гольцом, обитающими симпатрично в районе нижнего течения р. Камчатка и в бассейне оз. Кроноцкое, с использованием более обширного, чем в нашей предыдущей работе (Салменкова и др., 2005), набора микросателлитных локу-сов. В связи с высоким уровнем изменчивости микросателлитные локусы оказываются, как правило, весьма эффективными при выявлении дифференциации. Для сравнения тем же методом исследованы выборки южной формы мальмы S. malma krascheninnikovi из Приморья, которая по кариологическим характеристикам (Фролов и др., 1997) и по мтДНК (Олейник и др., 2005) отличается от северной формы мальмы практически на межвидовом уровне.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материалом исследования явились выборки S. albus и S. malma malma, в сентябре 2006 г. отловленные в протоке Азабачья, соединяющей оз. Азабачье с р. Камчатка, и в р. Радуга, впадающей в р. Камчатка напротив протоки, и в 2003 г. — в оз. Кроноцкое (Камчатка). Кроме того, исследованы 2 выборки южной формы мальмы, отловленные в 2006 г. в реках Большая Седанка и Суходол (южное Приморье).
Выделение тотальной ДНК из фиксированных этанолом образцов ткани мышц или плавников проводили стандартным методом (Маниатис и др., 1984). Использовали также способ выделения препаратов ДНК с набором реагентов Diatom DNA Prep 200 фирмы "ИзоГен" (Россия). Метод выделения ДНК не влиял на результат анализа. Амплифицировали 9 микросателлитных локусов (табл. 1) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), которую проводили в амплификаторе MJ Research РТС-100 с использованием готовых лиофилизированных смесей GenePakPCR Core фирмы "ИзоГен" (Россия). Инкубационная смесь объемом 20 мкл содержала буфер для ПЦР, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеотида (dTTP, dCTP, dATP, dGTP), 1.5 мМ MgCl2, 50 нг геномной ДНК и 100 нг специфического праймера. Реакцию начинали процессом денатурации в течение 2 мин при температуре 94°С, затем проводили 8 циклов, включающих 1 мин денатурации ДНК-матрицы при 94°, 30 с отжига праймеров при Х°С (температуру отжига для индивидуальной пары праймеров см. в табл. 1) и синтез новых цепей в течение 30 с при 72°; затем следовал 21 цикл, включающий 30 с при 94°, 30 с — Х°С и 15 с при 72°; элонгация — 3 мин при 72°С.
Аликвоты амплифицированных продуктов разделяли в вертикальном блоке 6%-ного недена-турирующего полиакриламидного геля в 0.5-кратном ТВЕ буфере рН 8.0 при 300 в в течение 2—5 ч. Полученные электрофореграммы
окрашивали бромистым этидием и просматривали на ультрахемископе.
В качестве маркеров длин фрагментов использовали ДНК плазмиды pBr322, обработанную ре-стриктазами HaeIII и HpaII. Размеры аллелей по каждому локусу определяли с использованием программы 1D Image analysis software (version 3.5) фирмы "Кодак".
Генетическую изменчивость в выборках оценивали числом аллелей, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностью микросателлитных локу-сов, применяя программу FSTAT version 2.93 (Goudet, 2001). Отклонение от равновесия Хар-ди—Вайнберга по каждому локусу в каждой выборке оценивали, определяя с использованием метода марковских цепей точную величину вероятности (p). Эти оценки, а также тесты на геноти-пическое неравновесие по сцеплению для всех пар локусов в каждой выборке и тесты на геноти-пическую и генную дифференциацию между выборками осуществляли с помощью программы GENEPOP ver. 4.0 (Rousset, 2007). Величину межвыборочной дифференциации оценивали двумя показателями: коэффициентом генетической подразделенности (FST), который определяется на основе вариансы частот аллелей (по Weir, Cocker-ham, 1984), и его аналогом — pST, который определяется на основе вариансы размера аллелей (по Rousset, 1996). Для определения статистической значимости величин FST использовали тесты той же программы на генную дифференциацию по аллельным частотам, а значимость величин pST оценивали по Гудману (Goodman, 1997). Во всех случаях множественных тестов корректировали уровни значимости по Бонферрони.
Для обнаружения предполагаемой генетической подразделенности между S. albus и S. malma malma суммарные выборки этих видов анализировали с помощью программы STRUCTURE 2.2 (Pritchard et al., 2000). Эта программа способна выявить структуру генетически подразделенной популяции, определяя путем моделирования на основе многолокусных генотипов особей вероятность задаваемого числа генетически самостоятельных групп, или кластеров (К), методом Марковских цепей—Монте-Карло (MCMC). Согласно рекомендациям программы использовали модель, допускающую гибридное происхождение особей в анализируемой выборке и корреляцию ал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.