ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 5, с. 602-610
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575.224.232.5:599.9
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ СИНДРОМА ДЕЛЕЦИИ 22q11.2
© 2014 г. Ю. О. Козлова1, В. В. Забненкова1, Н. В. Шилова1, М. Е. Миньженкова1, В. Г. Антоненко1, Н. П. Котлукова2, Л. В. Симонова2, И. А. Казанцева2, Е. Г. Левченко3, Т. Д. Бомбардирова2, Т. В. Золотухина1, А. В. Поляков1
Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва 115478
e-mail: kozlova.julie@gmail.com 2Городская клиническая больница № 67им. Л.А. Ворохобова, Москва 123423 3Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.И. Бакулева Российской академии медицинских наук, Москва 121552 Поступила в редакцию 18.10.2013 г.
В группе из 140 пациентов с характерными фенотипическими признаками методами FISH и MLPA была обнаружена микроделеция 22q11.2 у 43 пациентов (32%). Делеций в локусах других хромосом, ведущих к возникновению фенотипических признаков, схожих с таковыми при синдромах делеции 22q11.2 (СД22q11.2), методом MLPA обнаружено не было. При секвенировании гена TBX1 мутаций не было выявлено, зарегистрировано лишь несколько встречающихся часто вариантов нейтрального полиморфизма. Впервые в Российской Федерации благодаря применению комплекса генетических методов исследования на большой выборке пациентов с подозрением на СД22q11.2 эффективность диагностики синдрома составила 32%.
DOI: 10.7868/S0016675814050087
Группа синдромов, обусловленных микроде-лецией в районе д11.2 хромосомы 22, включает в себя несколько заболеваний с различными названиями и во многом перекрещивающимися признаками. К ним относятся вело-кардио-фациаль-ный синдром, синдром конотрункальных и лицевых аномалий и синдром Ди Джорджи. Эта микроделеция встречается с частотой одна на 4000 новорожденных и считается самой распространенной в популяции человека [1]. В настоящее время используется название "синдром делеции 22q11.2" (СД22ц11.2). Однако широко употребимы, более приняты и понятны врачам такие устоявшиеся названия заболеваний, как "синдром Ди Джорджи" и "вело-кардио-фациальный синдром". Подразумевается, что этиологически эти заболевания идентичны, так как вызваны одной деле-цией 22q11.2. Размер этой микроделеции, который обычно составляет от 1.5 до 3 млн пн, обусловливает невозможность ее выявления при стандартном ци-тогенетическом исследовании.
Наблюдение семей с носительством транслокаций, включающих критический регион, и про-бандов с характерным фенотипом и с несбалансированным кариотипом (моносомией по региону д11.2 хромосомы 22) позволило предположить, что гаплонедостаточность именно этого участка хромосомы 22 ведет к такой совокупности фено-типических проявлений. Эти работы относятся к восьмидесятым годам прошлого столетия [2, 3].
Несколько позже, в начале девяностых годов, этиология заболевания была подтверждена на молекулярном уровне [4—6].
Среди пациентов с подтвержденной микроде-лецией 22q11.2 отмечается выраженный клинический полиморфизм. Описано более 180 клинических признаков в различном сочетании, затрагивающих почти все органы и системы органов человека. Преобладают врожденные пороки сердца (ВПС) и магистральных сосудов, снижение иммунитета, связанное с аномалиями развития тимуса, которые являются причиной хронических заболеваний и смертности. Также часто встречаются патология мочевыделительной системы, аномалии развития твердого и мягкого неба, различные лицевые дисморфии, нарушения со стороны центральной нервной системы, психические заболевания и умственная отсталость [7].
Перечисление основных симптомов, формирующих группу СД22q11.2, свидетельствует о большом разнообразии признаков, осложняющем дифференциальную диагностику этих заболеваний на основании только клинических описаний. Пациенты с СД22q11.2 могут наблюдаться специалистами разного профиля — кардиологами, хирургами, иммунологами, неврологами и др., в зависимости от превалирующего проявления заболевания. Однако при постановке диагноза СД22q11.2 необходимо учитывать и другие возможные проявления, характерные для этой груп-
пы синдромов. Например, умственная отсталость различной степени тяжести, ассоциированная с делецией 22q11.2, наблюдается примерно у половины пациентов. Существуют также достоверные данные о повышенной вероятности развития у них расстройств шизофренического спектра, которые могут проявиться в более позднем возрасте. Поэтому необходима мотивация врачей различных специальностей в постановке диагноза при подозрении на СД22q11.2 у пациентов. Для диагностики СД22q11.2 применяют как прямые, так и косвенные методы выявления микроделеции, основанные на молекулярном или молекулярно-цитогенетическом подходе.
Метод STR-маркеров — это косвенный молекулярный метод диагностики СД22q11.2, основанный на анализе полиморфизма микросател-литных последовательностей, перекрывающих область делеции 22q11.2. Он позволяет выявить наличие делеции и оценить ее размер. Исследование проводится на основе семейного анализа с использованием образцов крови ребенка и его родителей.
Однако при STR-анализе некоторые делеции могут не выявляться, поэтому возникает острая необходимость использования прямой диагностики синдромов молекулярными или молеку-лярно-цитогенетическими методами.
Наиболее распространенным в клинической практике считается молекулярно-цитогенетиче-ский метод с использованием флуоресцентной in situ гибридизации (FISH-метод) с локус-специ-фичными ДНК-зондами на критический для данной микроделеции район q11.2 длинного плеча хромосомы 22. FISH-метод является прямым, таргетным и позволяет напрямую определить наличие или отсутствие делеции у пациента. Использование коммерчески доступных ДНК-проб на критический по микроделеции регион позволяет выявлять большинство всех микроделеций 22q11.2 [8].
Мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) является еще одним современным "прямым" количественным высокоточным методом молекулярной диагностики генного дисбаланса вообще и делеции 22q11.2 в частности, не требующим семейного анализа. MLPA позволяет в одной реакции не только детектировать делецию и определить ее размер, но и выявить наличие в других хромосомах дефектов ДНК, вызывающих сходные клинические проявления.
Микроделеция и ее размеры могут быть выявлены также с помощью метода сравнительной геномной гибридизации на чипах (array-CGH). Комплекс современных молекулярных методов, таких как микроматричный анализ, MLPA,
qPCR, позволяет значительно увеличить эффективность и чувствительность диагностики субмикроскопических аберраций, в том числе CR22q11.2 [9, 10].
Существует несколько микроделеционных синдромов, спектр фенотипических признаков которых формируется в связи с мутацией в одном гене. К ним относятся синдром Рубинштейна— Тейби, синдром Ангельмана и синдром Алажиля. Принимая во внимание то, что причиной некоторых генетических заболеваний может служить не более протяженная микроделеция, а мутация внутри одного гена, мы предприняли попытку поиска мутаций в гене TBX1, который в настоящее время считается ответственным за формирование большинства фенотипических признаков, характерных для СД22q11.2 [11].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
При анализе базы данных фенотипических признаков у пациентов с СД22q11.2 было определено ядро "сигнального фенотипа". На этой основе нами разработана карта-анкета для формирования группы риска и направления пациентов на молекулярно-цитогенетическое исследование СД22q11.2. Пациенты направлялись на диагностику микроделеции 22q11.2 преимущественно из клинических отделений кардиологического профиля в основном при наличии и/или сочетании следующих фенотипических признаков: ВПС, характерные черепно-лицевые дисморфии (большой нос с узким основанием крыльев, узкие глазные щели, маленькая нижняя челюсть), аномалии ушных раковин, длинные тонкие пальцы рук. Дополнительно учитывались такие признаки, как гипокальциемия и расщелины неба и/или губы.
За период с 2010 по 2012 г. включительно цито-генетически и молекулярно-цитогенетически обследовано 140 пациентов с фенотипом, характерным для группы синдромов, связанных с микро-делецией 22q11.2. Возраст пациентов варьировал от нескольких дней до 15 лет. Половой состав был следующим: 62 мальчика и 78 девочек.
Во всех случаях было проведено стандартное цитогенетическое исследование GTG-методом на уровне 500 бэндов.
Молекулярно-цитогенетическая диагностика была проведена методом FISH в 137 случаях пациентам с нормальным кариотипом на препаратах из культур лимфоцитов периферической крови с ло-кус-специфичным ДНК-зондом TUPLE1/ARSA (Abbott Molecular) на критический регион по микроделеции 22q11.2, в соответствии с протоколом фирмы-производителя.
В 77 случаях параллельно с FISH был использован метод MLPA. Материалом для исследования служили образцы ДНК, выделенной из лим-
Таблица 1. Последовательности праймеров для секвенирования гена ТВХ1 и условия для проведения ПЦР
Ген TBX1 Последовательности праймеров Температура отжига, °С
Экзон 1 5'-CGCCTCACCTTCCTGATCCAC 62
3'-GAACGCAGCGCCTCAGCAC
Экзон 2 5'-CGCGCGGAGCCCGCTGTC 62
3'-GCCCCACAGCAGCTGAGGC
Экзон 3 (1) 5'-GTGTCCAGCCCGTGGCTCAC 57
3'-CGCAAACGGGTAGGCGTGC
Экзон 3 (2) 5'-CGCACGCCTACCCGTTTGC 57
3'-GCAGCCCTGGCGGCAGCAC
Экзон 4 5'-GAGCAGAGGGGCCGCCAGC 62
3'-CCCGCCACTTTCCAGGGTGC
Экзон 5 5'-GGCCCTCTGGGTTCACCTC 62
3'-GGCGGGTGCCTCGGGACTC
Экзон 6 5'-CCCACCCCAGATCCTCAGC 62
3'-CAACTGAAAATTACACCCGCTTTTCC
Экзоны 7—8 5'-CCCTATCCTCCGCCGAGGTC 62
3'-GCGCGCACAGGGCCGGAAC
Экзон 9 (1) 5'-CGGCCAAGAGCCTTCTCTCC 60
3'-CCCGAGATAGTGGTCGTAGGC
Экзон 9 (2) 5'-CATCGGAGCCGCTGCACCAC 60
3'-CTTCGGGGCTGTGCAGGACC
фоцитов периферической крови пробандов, взятой с ЭДТА, методом фенол-хлороформной экстракции, и из взвесей клеток культуры лимфоцитов в фиксаторе Карнуа. В последнем случае выделение ДНК проводили с помощью набора Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) по протоколу производителя. В исследовании методом MLPA для выявления аберраций в локусе 22q11.2 использовали набор P
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.