ЛЕСОВЕДЕНИЕ, 2004, № 6, с. 34-41
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 630*165.3:582.475.2
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА ЛИСТВЕННИЦ ПРИМОРСКОГО КРАЯ
© 2004 г. М. М. Козыренко, Е. В. Артшкова, Г. Д. Реунова, И. Ю. Адрианова, Ю. Н. Журавлев
Биолого-почвенный институт ДВО РАН 690022 Владивосток, просп. 100-летия Владивостока, 159 Поступила в редакцию 01.07.2003 г.
Дана оценка генетической изменчивости и характеристика популяционной структуры лиственницы в Приморском крае по вариабельности 236 ЯЛРБ-локусов. Рассчитаны показатели, характеризующие уровень полиморфизма и генетического разнообразия. В исследуемых популяциях 32-67% генов находится в полиморфном состоянии, число аллелей на локус варьирует от 1.32 до 1.67, эффективное число аллелей 1.20-1.33, средняя ожидаемая гетерозиготность 0.1189-0.2825. Более 34% всей генетической изменчивости приходится на межпопуляционную составляющую и около 66% находится внутри популяций. Средняя величина генного потока менее 2. Значения генетических дистанций между исследуемыми популяциями находятся в пределах 0.0565-0.1487 и соизмеримы с межвидовыми значениями для рода Ьапх.
Лиственница, ЯАРО-анализ, генетическая изменчивость.
Лиственницы изучались многими исследователями, и история их систематики довольно подробно освещена в обзорных работах [1, 2, 4, 5, 8]. Однако до сих пор нет единого мнения о приоритетных научных названиях и числе видов лиственниц. Разные исследователи к роду Larix относят 1420 видов [2, 5, 6]. Особенно противоречивым является вопрос относительно видового разнообразия лиственниц юга российского Дальнего Востока. Богатый и оригинальный материал по лиственницам Приморского края представлен в работах Б.П. Колесникова [8]. Признавая все выделенные до него таксоны (L. olgensis, L. maritima, L. lubar-skii), он описывает еще три вида: L. komarovii, L. middendorfii, L. ochotensis, и предварительно называет четвертый - L. amurensis. Е.Г. Бобров [2] все наблюдаемые формы в Приморском крае, за исключением L. olgensis, относит к комплексу, сложившемуся в результате последовательной интрогрессивной гибридизации L. gmelinii и L. ka-mtschatica, а затем и L. olgensis. Г.В. Гуков [4] выделяет 6 видов: L. olgensis, L. komarovii, L. amuren-sis, L. ochotensis, L. maritima, L. lubarskii. С.П. Речан [12] при изучении видового разнообразия лиственницы по диагностическим признакам установлено, что на Сихотэ-Алине распространены: L. gmelinii, L. olgensis, L. maritima, L. amu-rensis, L. komarovii и L. ochotensis, ареалы которых перекрываются, в связи с чем наблюдается высокая полиморфность ценопопуляций и параллелизм многих признаков у некоторых видов. Это
свидетельствует о широко идущих процессах интрогрессивной гибридизации.
В практике ведения лесного хозяйства Приморья видовой состав лиственничных лесов не учитывается, что приводит к быстрому сокращению запасов лесов, сформированных некоторыми реликтовыми таксонами лиственницы. Кроме того, активно протекающий процесс гибридизации, если не принять адекватных мер, может привести к утрате аборигенных видов, например, признаваемого большинством авторов L. olgensis, распространение которого в России ограничивается небольшой прибрежной территорией Японского моря и восточными предгорьями Сихотэ-Алиня [4].
Мероприятия по сохранению биоразнообразия должны опираться на знание генофондов, микроэволюционных процессов, протекающих в популяциях и т.д. Эти знания возможно получить только с применением современных молекуляр-но-генетических методов исследования популяций и видов. В последние годы методом аллозим-ного анализа проанализированы генофонды более 50 видов хвойных, в том числе таких видов лиственниц, как L. dahurica [11], L. occidentalis [17], L. laricina [27], L. sibirica [10, 16], L. sukaczewii [10, 14, 15], L. kurilensis [3], L. kaempferi [3], L. decidua [25, 26]. Исследованы генетические взаимоотношения между евроазиатскими [35] и евроазиатскими и американскими видами лиственниц [34]. Для анализа генетической изменчивости, построения генетических карт и исследования филогенетических отношений некоторых видов
хвойных успешно используются молекулярно-ге-нетические маркеры, основанные на использовании метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) [19-22, 33].
Популяционно-генетические исследования лиственниц, произрастающих на территории Приморского края, кроме L. olgensis [35], до сих пор не проводились. Целью данного исследования является оценка генетической изменчивости и характеристика популяционной структуры лиственницы в Приморском крае методом RAPD (random amplified polymorphic DNA - случайно амплифицированные полиморфные ДНК).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования служила хвоя деревьев из 5 природных популяций четырех видов лиственницы с территории Приморского края по Г.В. Гукову [4]: L. olgensis A. Henry - верховья р. Арзамазовки, падь Вымойная, 43°90' с.ш., 135°21' в.д. (ольгинская популяция, n = 3); L. komarovii B. Kolesn. - две популяции: одна - верховья р. Лагерной, 45°70' с.ш., 136°35' в.д. (популяция Комарова-1, n = 5), вторая - р. Верхний Иртыш, 45°05' с.ш., 135°80' в.д. (популяция Комаро-ва-2, n = 9); L. ochotensis B. Kolesn. - перевал Веселый, 45°48' с.ш., 137° в.д., (охотская популяция, n = 5); L. amurensis B. Kolesn. - ручей Хрейма-нов, 45°46' с.ш., 134°14' в.д. (амурская популяция, n = 9).
Геномную ДНК выделяли из 300-500 мг свежей хвои по методике [21] с небольшими модификациями.
ПЦР проводили в термоциклере UNO II 48 (Biometra, Germany) с 10-нуклеотидными прайме-рами произвольной последовательности (Operon Technologies Inc., США), используя реакционную смесь и температурный режим, описанные нами ранее [7]. Контрольная проба содержала полную амплификационную смесь, но без добавления ДНК. Каждую реакцию ставили в 2-4-х повтор-ностях. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1.4%-х агарозных гелях в присутствии бромистого этидия и фотографировали в УФ свете. Для определения размеров фрагментов (ампликонов) в качестве маркеров молекулярных масс использовали EcoRI + Яг^Ш-ресгрикты ДНК фага лямбда (Fermentas, Литва). При анализе электрофореграмм учитывали только четко видимые и воспроизводящиеся в повторных экспериментах фрагменты. Разная интенсивность полос одинаковых по размеру ампликонов у сравниваемых образцов не учитывалась.
Статистическая обработка RAPD-феноти-
пов проводилась с помощью компьютерного сравнительного анализа полос в RAPD-спектрах исследуемых образцов. Данные были представле-
ны в виде бинарных матриц, в которых присутствие или отсутствие в спектре одинаковых фрагментов обозначали как 1 или 0. Используя пакеты программ РОРвЕКЕ [36] и ТБРвА [29], для каждой популяции по всем исследуемым локусам рассчитывали долю полиморфных локусов при 95%-м критерии (Р95), число аллелей на локус (А), эффективное число аллелей на локус (Ае) и среднюю ожидаемую гетерозиготность (Не).
В данном исследовании мы использовали диплоидный материал, поэтому для получения несмещенных оценок частоты аллелей ЯАРБ-локу-сов рассчитывались непрямым методом на основе частот индивидуумов, у которых данный фрагмент отсутствует. ЯАРБ-локусы, частота которых больше 1 - (3/п), где п - число анализируемых деревьев в популяции, исключались из анализа [19, 28]. Среднее выборочное генное разнообразие (НБ), общее генное разнообразие в суммарной выборке (НТ) и показатель подразделенности (^ет) рассчитывали по [31].
Для расчета коэффициента попарного сходства между особями использовали формулу: Б = = 2ИаЬ/(Иа + Иь), где ИаЬ - число одинаковых фрагментов у особей а и Ь, Иа и Иь - число фрагментов у особей а и Ь [32]. На основании значений Б между индивидуумами в каждой выборке рассчитывали среднее внутригрупповое сходство (Брор). На основе матриц значений Ом [30] построены денд-рограммы генетических взаимоотношений между исследуемыми популяциями методом ИРвМА с бутстрэпными оценками степени надежности порядка ветвления (1000 реплик).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее мы исследовали возможность применения ЯАРБ-анализа для изучения генетической вариабельности дальневосточных лиственниц [13]. Из 84 тестируемых произвольных праймеров эффективными в ПЦР с ДНК лиственницы оказались 50, слабый синтез давали 22 и не инициировали синтез продуктов амплификации 12 праймеров. В настоящей работе использовали 12 праймеров из числа эффективных (табл. 1). Каждому из них соответствовал специфический паттерн, отличающийся от других числом и размерами фрагментов, а также степенью их выраженности (рис. 1). Число ампликонов варьировало от 11 (0РА-03) до 24 (ОРА-19). Сравнение ЯАРБ-спектров позволило проследить вариабельность 236 ЯАРБ-локусов (в среднем 19.7 локуса на праймер), из них 224 оказались полиморфными. Не обнаружено маркерных аллелей, встречающихся только в одной популяции и отсутствующих в остальных. Выявлены различия в аллельных частотах подавляющего большинства локусов между популяциями.
Таблица 1. Генетическая изменчивость, выявляемая с помощью праймеров
Праймер Нуклеотидная последовательность (5' — 3') Число локусов в популяциях Общее число учитываемых локусов
1 2 3 4 5
0РЛ-01 СЛООСССТТС 6/11 7/12 11/14 7/10 7/11 18
0РЛ-03 ЛОТСЛОССЛС 2/5 4/7 7/9 4/7 7/10 11
0РЛ-07 ОЛЛЛСОООТО 13/16 19/21 15/17 8/13 10/15 23
0РЛ-09 оаатЛЛСОСС 11/13 14/16 18/20 6/11 14/16 22
ОРЛ-11 СЛЛТСОССОТ 9/10 13/14 16/17 6/8 9/10 20
ОРЛ-12 ТСООСОЛТЛО 11/13 10/12 9/10 6/8 12/15 19
ОРЛ-19 СЛЛЛСОТСаа 15/16 11/13 18/19 11/13 14/14 24
0РЛ-20 ОТТОСОЛТСС 13/17 16/18 14/15 9/14 11/15 21
0РВ-10 СТОСТОООЛС 10/11 9/13 12/14 4/7 10/14 20
0РВ-11 ОТЛОЛСССОТ 13/15 10/14 14/15 3/9 8/14 17
0РС-02 ОТОЛООСОТС 9/12 16/18 14/16 9/13 13/15 23
0РС-19 ОТТОССЛОСС 7/10 13/16 11/13 3/6 11/14 18
Всего 119/149 142/174 159/181 76/119 126/163 236
Примечание. 1 - популяция Комарова-1, 2 - Комарова-2, 3 - амурская, 4 - ольгинская, 5 - охотская. В числителе - число полиморфных локусов, в знаменателе - число учитываемых локусов.
В табл. 2 представлены значения основных показателей генетического полиморфизма, рассчитанные на основании аллельных часто
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.