ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 5, с. 581-590
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.174.015.3:599.742.4
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ СОБОЛЯ Martes zibellina L., ЛЕСНОЙ КУНИЦЫ M. martes L. И ИХ ГИБРИДОВ В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ:
ПОЛИМОРФИЗМ БЕЛКОВ И ДНК
© 2014 г. О. Н. Жигилева1, Д. В. Политов2, И. М. Головачева1, С. В. Петровичева3
1 Тюменский государственный университет, кафедра экологии и генетики, Тюмень 625003
e-mail: zhigileva@mail.ru
2 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991
e-mail: dvp@vigg.ru
3 Управление по охране, контролю и регулированию использования объектов животного мира
и среды их обитания Тюменской области, Тюмень 625003 e-mail: PetrovichevaSV@72to.ru Поступила в редакцию 22.10.2013 г.
С использованием четырех видов маркеров исследована генетическая изменчивость соболя и лесной куницы, обитающих в Западной Сибири. Изоферментный анализ, рестрикционный анализ фрагмента гена цитохрома b мтДНК, ISSR-PCR и анализ изменчивости микросателлитных локусов выявили низкую степень дифференциации соболя и лесной куницы и подтвердили гибридное происхождение атипичных особей этих видов. Гибриды имеют повышенный уровень гетерозиготности и генетически ближе к соболю, чем к кунице. У атипичных куниц присутствуют гаплотипы мтДНК восточного соболя. Это может быть последствием реинтродукции баргузинского соболя в ХХ в. В то же время у типичного западносибирского соболя гаплотипы восточного соболя редки. Интрогрес-сия генов между соболем и лесной куницей в Западной Сибири имеет массовый, симметричный характер и, по-видимому, происходила в прошлом и продолжается в современную эпоху.
DOI: 10.7868/S0016675814050130
Соболь Martes zibellina L., 1758 — один из наиболее ценных охотничье-промысловых видов лесной зоны Сибири. В результате перепромысла к концу XIX в. численность соболя резко сократилась и была восстановлена в 70-х годах XX в. благодаря введению запрета на добычу, организации заповедников и реинтродукции. На территории Западной Сибири в период депрессии численности сохранялись небольшие местные популяции, тем не менее для ускорения восстановления численности был произведен выпуск нескольких тысяч особей [1, 2]. По результатам морфологических исследований, в настоящее время в одних районах Тюменской области обитают автохтонные, в других — аллохтонные популяции соболя [3, 4]. О генетических последствиях реакклимати-зации ничего не известно. Ситуация осложняется еще и тем, что в Западной Сибири и на Урале ареал соболя перекрывается с ареалом близкородственного вида — лесной куницы Martes martes L., 1758. В зоне симпатрии возможно появление гибридов — кидусов, фенотипически более близких соболю (атипичный соболь) или кунице (атипичная куница). Доказано [5], что кидус при скрещивании с исходными формами вполне плодовит. Частота встречаемости атипичных особей в некоторых районах Ханты-Мансийского автономного
округа может быть более 50% всех добытых животных [6]. Высокая частота встречаемости гибридов может быть следствием депрессии численности соболя первой половины ХХ в., поскольку в условиях низкой плотности популяции возрастает вероятность гибридизации с особями близкородственного вида. В последние годы наблюдается рост численности соболя и расширение его ареала на юг в лесостепные районы Тюменской области (где он был истреблен еще в XVIII в.). Этот процесс сопровождается сокращением доли типичных и увеличением числа гибридных, атипичных, куниц.
Межвидовая гибридизация — широко распространенное явление среди куньих [7]. Для идентификации близких видов куньих и их межвидовых гибридов в Европе, Америке и Японии широко используются данные рестрикционного анализа Э-петли митохондриальной ДНК (мтДНК) [8], се-квенирования гена цитохрома Ь мтДНК [9—11] и ядерной рибосомальной ДНК [12], данные алло-зимов и микросателлитов [13—21]. Идентификация гибридов и родительских видов, обитающих в Западной Сибири, производится на основе анализа краниометрических признаков [22], но затруднена по молекулярно-генетическим данным [23]. Настоящая работа посвящена изучению ге-
Рис. 1. Места сбора материала: 1 — Тобольский, 2 — Вагайский, 3 — Уватский, 4 — Нефтеюганский, 5 — Исетский, 6 — Тюменский, 7 — Ялуторовский, 8 — Нижнетавдинский, 9 — Советский районы Тюменской области.
нетической изменчивости соболя и лесной куницы с целью выяснения статуса атипичных особей и поиска молекулярных маркеров гибридизации, которые могут быть использованы для изучения микроэволюционных процессов в зоне симпатрии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования послужили соболь и лесная куница, а также их гибриды, добытые охотниками в промысловые сезоны 2008— 2009 и 2009—2010 гг. в Советском, Тобольском, Вагайском, Уватском, Нефтеюганском, Исет-ском, Ялуторовском, Нижнетавдинском и Тюменском районах Тюменской области (рис. 1). Все животные были разбиты на четыре группы в соответствии с результатами дискриминантного анализа остеологических признаков по методике, описанной ранее [24]. Всего исследовано 166 осо-
бей, в том числе 61 — типичных соболей, 48 — атипичных соболей, 48 — атипичных куниц и 9 — типичных лесных куниц.
Для изоферментного анализа использовали образцы мышечной ткани, которые хранились в замороженном состоянии при —20°С. Белки экстрагировали стандартным способом с использованием трис-HCl буфера (pH 8.0). Для разделения белков применяли методы вертикального электрофореза в 7.5%-ном полиакриламидном геле [25] и горизонтального электрофореза в 13%-ном крахмальном геле. Вертикальный электрофорез проводили в камере фирмы "Helicon" при силе тока 80 мА, напряжении 200 B в течение 2.5 ч; горизонтальный — при силе тока 75 мА, напряжении 180 B в течение 4.5 ч. Буферные системы и ферменты представлены в табл. 1. Всего изучено 16 ферментных систем.
Таблица 1. Ферменты и буферные системы
Фермент Локус Буферная система Гель
Лактатдегидрогеназа Ldh-1,2 Крахмал, A Крахмальный
Супероксиддисмутаза Sod-1,2 » »
Эстераза D Fest-1 » »
Фосфоглюкоизомераза Pgi-1 » »
Малатдегидрогеназа Mdh-1,2 Крахмал, B »
а-Глицерофосфатдегидрогеназа G3pgh-1 » »
Аспартатаминотрансфераза Aat-1 » »
Маликэнзим Me-1,2 » »
Маннозо-фосфатизомераза Mpi-1 » »
Изоцитратдегидрогеназа Idh-1,2 Крахмал, C »
Креатинкиназа Ck-1,2 » »
Фосфоглюкомутаза Pgm-1,2 » »
6-Фосфоглюкодегидрогеназа 6Pgd-1 » »
Аконитаза Aco-1 » »
Неспецифические эстеразы Est-1,2,3 ПААГ, D ПААГ
Миогены My-1—8 » »
Примечание. А — трис-цитрат/ЬЮН-боратная система [26], B и С — морфолин-цитратная, pH 8.0 и 6.5 соответственно [27], D — трис-ЭДТА-боратная [28].
Для изучения полиморфизма ДНК использовали три метода — рестрикционный анализ фрагмента гена цитохрома b мтДНК, ISSR-PCR и анализ изменчивости микросателлитных локусов. ДНК экстрагировали из сердечной мышечной ткани, фиксированной в 70%-ном этаноле, с применением набора для выделения ДНК Diatom® DNA Prep 100 (ООО "Лаборатория Изоген", Москва). Для рестрикционного анализа гена цитохрома b мтДНК использовали последовательности праймеров из работы, опубликованной ранее [29], и эндонуклеазы HaelII, BstNI, TaqI. Выбор рестриктаз обусловлен наличием соответствующих сайтов рестрикции в анализируемом участке митохондриального генома как соболя, так и лесной куницы [30]. ПЦР фрагмента гена цитохрома b мтДНК проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей IQ supermix ("Bio-Rad"), 3 мкл тотальной ДНК и 2.5 мкл каждого из праймеров, на амплификаторе DNA Engine Dyad® и Chromo-4 ("Bio-Rad") в следующем режиме: 94°С — 5 мин; затем 33 цикла 94°С —
1 мин, 51°С - 1 мин, 72°С - 1 мин 45 с; 72°С -
2 мин. Электрофоретическое разделение ре-стрикционных фрагментов проводили в 2.5%-ном агарозном геле. Длины фрагментов определяли с помощью маркера молекулярных масс ДНК GeneRuler™ DNA Ladder mix ("Fermentas", Литва). Для ISSR-PCR использовали пять праймеров: (AG)8C, (GT)8C, (TC)8C, (AC)8T и (TG)8A. Амплификацию последовательностей, ограниченных простыми повторами, проводили в 25 мкл
реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер (0.01 M трис-На, 0.05 M KCl, 0.1%-ный тритон Х-100), 4 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого из dNTPs, 1 мкл раствора тотальной ДНК, 2.5 мМ праймера и 0.2 ед/мкл Taq-полимеразы ("Fermentas"), на амплификаторе Chromo-4 ("Bio-Rad") в следующем режиме: 94°С - 7 мин; затем 94°С - 30 с, 52(56)°С - 45 с, 72°С - 2 мин (40 циклов), 72°С -7 мин. Анализ ISSR-PCR-фрагментов осуществляли в 2%-ном агарозном геле. Для ПЦР микросателлитов использовали праймеры для локусов Elul, Elu2, Elu6 и режимы амплификации, описанные в работе [21]. Фракции микросателлитов анализировали в 6%-ном полиакриламидном геле. Для определения размеров аллелей применяли маркер молекулярных масс ДНК - плазмиду pBR322, обработанную рестриктазой HpaII ("Fermentas"). Визуализацию продуктов ПЦР и рестрикции производили путем окрашивания гелей в растворе бромистого этидия и наблюдения в УФ-свете с записью цифрового изображения на системе гель-документации Kodak 1D.
Популяционно-генетический анализ осуществляли с использованием программы POPGEN [31]. Дендрограммы строили на основании индексов генетического подобия Нея по частотам аллелей всех изученных локусов, включая мономорфные. Для построения дендрограмм пользовались методом UPGMA с помощью пакета прикладных программ PHYLIP version 3.5 [32].
-Тобольский
_ _Нефтеюганский
-Уватский
Тюменский
-Нижнетавдинский
-Ялуторовский
Советский
I_I_I_I_I_I_I_I
0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0
Рис. 2. UPGMA-дендрограмма, построенная на основании генетических дистанций [42] по изоферментным маркерам соболя, обитающего в разных районах.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изоферментный анализ
Из 32 исследованных локусов мономорфны и идентичны у соболя, лесной куницы и гибридов оказались 22: Ldh-1,2, Бой-1, Еез1-1, Ыйк-2,
Ме-2, Ы^2, Ск-1,2, Рт-1,2, Асо-1, Му-1-8, ЕШ-3. Во всех группах полиморфными были локусы Mdh-1, Ез1-1,2. Кроме того, редкие электрофоре-тические варианты ферментов выявлены у атипичной куницы — по локусам G3pgh-1, Idh-1, 6Pgd-1, АШ-1, у атипичного соболя — 6Pgd-1, Sod-2, у соболя — Ме-1, 6Pgd-1, Мр1-1. Дифференцирующ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.