ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 3, с. 289-294
УДК 579.22
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА Methylobacterium extorquens G10
© 2014 г. Д. Н. Федоров*, С. А. Замахаева**, В. А. Ежов*, Н. В. Доронина**, Ю. А. Троценко**
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, 142290 **Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино, 142290 e-mail: trotsenko@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 21.10.2013 г.
Изучено влияние увеличения копийности генов биосинтеза полигидроксибутирата (ПГБ) у розово-окрашенной метилобактерии Methylobacterium extorquens G10 на свойства биополимера. Показано, что при введении в клетки штамма-продуцента дополнительных копий генов phaC и phaCAB происходило повышение активности поли-3-гидроксибутирил-синтазы (ПГБ-синтазы) и двукратное снижение молекулярной массы (150 ^ 79 кДа) синтезируемого ПГБ, тогда как физико-химические свойства пластика изменялись мало. Установлено, что бесцветный мутант M. extorquens G10-W с нарушенным синтезом каротиноидного пигмента (дефект по гену crtI, кодирующему фитоенолдеса-туразу) имел такую же скорость роста и уровень накопления ПГБ, как и исходный штамм G10. Полученный штамм G10-W перспективен как продуцент со сниженной стоимостью очистки и биосинтеза ПГБ.
DOI: 10.7868/S0555109914030222
Открытие и изучение полигидроксибутирата (ПГБ) — полиэфира микробного происхождения, явилось значительным событием для биотехнологии новых материалов. ПГБ — термопластичный, биоразрушаемый и биосовместимый полимер, сферы применения которого потенциально широки, включая сельское хозяйство, медицину, пищевую и косметическую промышленность [1, 2].
Представители рода Ме1Ну1оЬас1вг1ит с серино-вым путем С1-метаболизма являются хорошо известными продуцентами ПГБ, способными накапливать 40—80% ПГБ от сухой биомассы при росте на метаноле [3—6]. Синтез ПГБ у метилобактерий тесно сопряжен с С1-метаболизмом, поскольку первые два фермента биосинтеза ПГБ, Р-кетотиолаза (РИаА) (КФ 2.3.1.9) и ацетоацетил-КоА-редуктаза (РИаБ) (КФ 1.1.1.36), являются частью недавно открытого этилмалонатного цикла регенерации гли-оксилата в сериновом пути [7]. У Ме1ку1оЬа&егшт ех1ощиет гены ркаЛ и ркаБ кластеризуются в хромосоме в опероне, тогда как ген ркаС, кодирующий ПГБ-синтазу (КФ 2.3.1.Б2), локализован отдельно и, по-видимому, регулируется независимо от генов ркаЛБ. Кроме того, представители рода Ме1ку1оЬас1епит являются розовоокрашенными, что требует введения стадии очистки ПГБ от ка-ротиноидного пигмента.
Цель работы — получение генетически модифицированных штаммов продуцента М. ех1ощиет 010 с нарушенным синтезом каротиноидов и увеличенной копийностью генов синтеза ПГБ, а также изу-
чение физико-химических свойств синтезируемого биопластика.
МЕТОДИКА
Культивирование метилобактерий. Объектами исследования служили исходный и мутантные штаммы Methylobacterium extorquens G10, синтезирующие ПГБ при росте на среде с метанолом [5]. Штаммы бактерий и плазмиды представлены в табл. 1. Штаммы M. extorquens G10 и бесцветный мутант G10-W (white) выращивали в минимальной среде K [12] при 28°C. Штаммы E. coli, также представленные в табл. 1, культивировали при 37°C в среде Лурия-Бертани [13] с добавлением соответствующих антибиотиков (мкг • мл-1): ампициллин — 100; гентамицин — 2.5; канамицин — 50. Антибиотики для M. extorquens добавляли в следующих концентрациях (мкг • мл-1): гентамицин — 20; канамицин — 50.
Общие методы. Выделение хромосомной и плаз-мидной ДНК, клонирование ДНК и трансформацию компетентных клеток проводили согласно стандартным методикам [13]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в реакционной смеси следующего состава (30 мкл): 1 х буфер для Pfu-ДНК-полимеразы, по 150 мкМ каждого из дез-оксирибонуклеотидтрифосфатов, по 200 нМ соответствующих праймеров, 100 нг геномной ДНК, 3% диметилсульфоксида ("Sigma", США), 2 ед. Pfu-ДНК-полимеразы. Для всех комбинаций прайме-ров использовали следующий температурно-вре-
Таблица 1. Штаммы бактерий и плазмиды
Штамм или плазмида Характеристика Ссылка
Escherichia coli
S17-1 thipro recA hsdR [RP4-2Tc::Mu-Km::Tn7] Tpr Smr [8]
T0P10 F- mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) <$80lacZAM\5 AlacX74 recA1 araD139 A(ara-leu) 7697 galUgalKrpsL (Strr) endA1 nupG X- "Invitrogen", США
Methylobacterium extorquens
G10 Штамм дикого типа
G10-W Бесцветный производный G10, AcrtI:: aacC1, Gmr Данная работа
Плазмиды
pK18mob Мобилизуемый суицидальный вектор для клонирования, Ктг [9]
p34S-Gm Вектор, содержащий 0тг-кассету, 0тг, Арг [10]
pCM160 Мобилизуемый вектор для экспрессии белков в M. extorquens под контролем промотора гена большой субъединицы метанолдегидрогеназы (mxaF), Ктг [11]
pK18mobcrtI рК18тоЬ, содержащий EcoRI/HindШ-фрагмент с геном crtI из M. extorquens 010, Ктг Данная работа
pK18mobcrtI-Gm Производная рК18тоЬсг11, содержащая клонированную по "затупленным" сайтам ХЬо1 0тг кассету из р348-0т, Ктг, 0тг То же
pCM160phaC рСМ160, содержащий 8рЫ/Асс651-фрагмент с геном phaC из M. extorquens 010, Ктг »
pCM160phaCAB рСМ160рЬаС, содержащий Acc65I/EcoRI-фрагмент с генами phaAB из M. extorquens 010, Ктг »
менной режим: начальная денатурация — 3 мин при 96°C; с последующими 30 циклами по 20 с при 94°C, 20 с при 60°C, 4 мин при 72°C; конечная полимеризация — 5 мин при 72°C. Все ПЦР-фрагменты очищали при помощи Wizard SV Gel and PCR Clean-up System ("Promega", США), согласно рекомендациям фирмы-производителя.
Получение делеции у M. extorquens G10 по гену crtl.
Ген crtI (NCBI locus tag MexAM1_META1p3665, номер доступа последовательности хромосомы в GenBank CP001510 для M. extroquens AM1) амплифици-ровали из ДНК штамма M. extorquens G10 с использованием праймеров:
crtI-F 5'-
CGGAATTCCAATGAGCCAGGGTTCTTCG-3'
и
crtI-R 5'-
TCGAAGCTTGCGGCCATGAACCGCCAGAG-3',
содержащих сайты для эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII соответственно. В результате лиги-рования ПЦР-продукта и вектора pK18mob, обработанных EcoRI и HindIII, получили вектор pK18mob-crtI. Затем в плазмиде pK18mob-crtI, раскрытой по сайтам XhoI, выступающие концы которой "затупили" в ДНК-полимеразной реакции,
клонировали SmaI-фрагмент (855 п.н) из плазмиды p34S-Gm, содержащей ген устойчивости к гентами-цину. Полученной плазмидой, pK18mobcrtI-Gm, трансформировали клетки E. coli S17-1, которые использовали для конъюгативного переноса в клетки M. extorquens G10, как описано ранее [14]. Бесцветные колонии трансконъюгантов отбирали на агари-зованной среде K с добавлением метанола и гента-мицина, а также дополнительно проверяли ПЦР на наличие мутантного аллеля.
Получение трансконъюгантов M. extorquens G10, экспрессирующих геныphaC и phaCAB под контролем промотора метанолдегидрогеназы (PmxaF). Для амплификации ПЦР-продуктов из хромосомы штамма G10, содержащих гены phaC (NCBI locus tag MexAM1_META1p3304) и phaAB (MexAM1_META1p3700, MexAM1_META1p3701), использовали следующие праймеры:
phaC-F (SphI) 5' - ATTATGCATGCTAGAC-CTTTGGGAGGACGTGTCG-3',
phaC-R (Acc65I) 5'-CGCGGTACCTGTCGATC-CCTCACCTTCATG-3',
phaAB-F (Acc65I) 5-ATGGTACCGCCGAAT-GAGGAGAACGTCAC-3',
phaAB-R (EcoRI) 5-CGGAATTCGAGAGCCT-TAGATCAGACGAAG- 3'.
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА 291
В скобках указаны сайты эндонуклеаз рестрикции, выделенные полужирным шрифтом, в последовательности ДНК. ПЦР-фрагмент, обработанный SphI и Acc65I, содержащий ген phaC, клонировали в векторе pCM160, раскрытом по тем же сайтам, под контролем PmxaF из M. extorquens AM1, в результате получили вектор pCM160phaC.
Затем ПЦР-продукт, содержащийphaAB, обработанный Acc65I и EcoRI, клонировали в плазми-де pCM160phaC, раскрытой по этим же сайтам.
В итоге получили плазмиду pCM160phaCAB, содержащую искусственный оперонphaCAB. Векторами pCM160phaC и pCM160phaCAB трансформировали клетки E. coli S17-1 и проводили двуродительское скрещивание с клетками M. extorquens G10-W по методу, описанному ранее [14]. Трансконъюгантов M. extorquens G10-W, несущих плазмиды pCM160phaC и pCM160phaCAB, отбирали на среде K с добавлением метанола и кана-мицина. Наличие белков PhaC, PhaA и PhaB в бесклеточных экстрактах подтверждали с помощью электрофореза в ПААГ с Na-ДДС [15].
Определение активности ПГБ-синтазы. Клетки в экспоненциальной фазе роста центрифугировали при 6000 g 30 мин и отмывали 0.05 M трис-HCl буфером, рН 7.4, ресуспендировали в том же буфере и обрабатывали ультразвуком на дезинтеграторе Misonix Sonicators ("Сole-Parmer", США) при 20 кГц (6 х 30 с) с использованием охлаждаемых кювет. Неразрушенные клетки и их фрагменты отделяли центрифугированием при 10000 g 15 мин. После повторного центрифугирования при 15000 g 30 мин получали супернатант (растворимую фракцию).
Активность ПГБ-синтазы измеряли спектро-фотометрически при 412 нм по скорости образования окрашенного продукта в присутствии 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты (ДТНБ). Реакционная смесь содержала (мкмоль/мл): трис-HCl — 50, pH 7.5, ДТНБ — 0.2, гидроксибу-тирил-KoA — 0.3, супернатант клеточного гомо-генанта. Реакцию начинали добавлением субстрата. Изменение оптической плотности реакционной смеси регистрировали в течение 5 мин при 30°C на спектрофотометре Shimadzu UV-1700 (Япония), оснащенном термостатируемой ячейкой. Активность фермента рассчитывали с учетом коэффициента экстинкции для ДТНБ 13600 см2/мкмоль. Концентрацию белка в супернатанте определяли методом Брэдфорд [16].
Выделение и определение физико-химических свойств ПГБ. ПГБ экстрагировали хлороформом из высушенной биомассы клеток бактерий по методу, описанному ранее [5]. К навеске сухой биомассы при перемешивании добавляли 6 об. метанола в течение 1 ч, затем центрифугировали при 5000 g 20 мин. К осадку при перемешивании добавляли 6 об. хлороформа в течение 3 ч. Суспен-
зию фильтровали через фильтровальную бумагу, экстракт осветляли 0.5% (вес/об.) активированного угля в течение 1 ч при перемешивании. Суспензию фильтровали через фильтровальную бумагу на воронке Бюхнера под вакуумом. Осветленный хлороформенный экстракт упаривали на роторном и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.