ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.174.015.3:582.475.2
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БОЛОТНЫХ И СУХОДОЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ СОСНЫ КЕДРОВОЙ СИБИРСКОЙ (Pinus sibirica Du Tour) ПО ЯДЕРНЫМ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМ ЛОКУСАМ
© 2014 г. Н. В. Орешкова, Т. С. Седельникова, А. В. Пименов, С. П. Ефремов
Институт леса им. В.Н. Сукачева Сибирского отделения Российской академии наук, Красноярск 660036
e-mail: oreshkova@ksc.krasn.ru Поступила в редакцию 19.02.2014 г.
С помощью маркеров ядерного генома проведена оценка популяционной структуры болотных и суходольных популяций сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica) в Западной Сибири. Для анализа использовали шесть ядерных микросателлитных локусов. У 120 особей четырех популяций P. sibirica были выявлены 30 аллельных вариантов. Установлено, что исследованные популяции сосны кедровой сибирской отличаются по генетической структуре, а наиболее существенные различия наблюдаются между популяцией данного вида с олиготрофного болота и группой популяций, включающей в себя выборки из суходола, евтрофного болота и припоселкового кедровника (FST = 0.019; Dn = 0.053). Дифференциация изученных западносибирских популяций P. sibirica по SSR-маркерам составляет 2.4% (FST = 0.024).
DOI: 10.7868/S0016675814090100
Сосна кедровая сибирская (Pinus sibirica Du Tour), или кедр сибирский, является одним из основных лесообразующих видов во многих районах Западной Сибири, где кедровые леса занимают 7667 тыс. га, или около 24% всей площади хвойных лесов [1]. В Западной Сибири в лесовод-ственном и селекционном отношениях достаточно хорошо исследованы естественные суходольные популяции сосны кедровой сибирской, включая припоселковые насаждения — окультуренные населением таежные кедровники [2—5]. Заболоченность территории Западно-Сибирской равнины определяет высокую мозаичность лесо-растительных условий сосны кедровой сибирской [6]. В южнотаежной подзоне Западной Сибири P. sibirica является типичным представителем болотных и заболоченных экотопов, занимая разнообразные по трофности местообитания [4, 7—9]. При этом значительная часть кедровников произрастает на болотах евтрофного типа водно-минерального питания [10], в отличие от олиготрофных болот, где сосна кедровая сибирская встречается значительно реже, в основном в виде куртин и одиночно растущих деревьев.
Вопросам дифференциации популяций сосны кедровой сибирской в болотных и суходольных условиях произрастания посвящены лишь несколько работ. Показано, что экотопические различия в популяциях P. sibirica, произрастающих на евтрофных болотах и суходолах, проявляются в изменчивости таких признаков, как активность заложения и сохранность женских и мужских стробилов, особенности пыльцевого режима,
морфологические параметры генеративных структур и качество урожая семян [6, 9—11]. Установлено, что кариотип сосны кедровой сибирской, произрастающей в условиях евтрофных болот Западной Сибири, отличается по морфомет-рическим параметрам хромосом от ранее изученных хромосомных наборов данного вида [12]. Сосна кедровая сибирская, произрастающая на олиготрофных болотах, исследована слабо. Описано несколько экологических форм Р. sibiri-са на олиготрофных болотах Западной Сибири, среди которых выделены угнетенная древовидная Г. turfosa [13] и кустарниковая карликовая Г. pumi-1а, характеризующаяся крайней степенью морфологической деградации и не образующая репродуктивных структур [14]. Выявлены различия по качеству семян между особями сосны кедровой сибирской, произрастающими на олиготрофных болотах и суходолах Западной Сибири [15].
Несмотря на проведенные для различных регионов Западной и Восточной Сибири обширные исследования аллозимной изменчивости в популяциях Р. sibirica, определяемой их географическим положением [16, 17], работы по выявлению роли экологических барьеров в формировании генетической структуры и дифференциации данного вида в болотных и суходольных местопроизрастаниях выполнены на единичных объектах [9, 18]. Так, в системе координат "увлажнение—богатство почвы" показаны особенности в структуре аллельного состава изоферментов и значительная подразделенность ценопопуляций сосны кедровой сибирской, произрастающих в болотных и
1059
4*
Таблица 1. Характеристика объектов исследования (популяций Р. нШпса) в южно-таежной подзоне Томской области
Код популяции Географические координаты Условия произрастания и тип леса Состав древостоя по запасу Характеристика деревьев Р. зШпса
общее число таксационные показатели
высота, м диаметр, м возраст, лет
К-1 56°54' с.ш., 83°04' в.д. Междуречье Иксы и Яри; суглинистый суходол; кедровник елово-пихтовый низкотравно-зеленомошный 5К2Е1.5П0.5Л1Б 30 32-38 36-58 227-384
К-2 56°33' с.ш., 84°04' в.д. Первая надпойменная терраса р. Обь; пос. Мельниково; супесчаный суходол; припоселковый кедровник осочково-разнотравный 10К ед. Б 30 29-36 31-52 186-262
К-3 56°20' с.ш., 84°34' в.д. Заторфованная долина р. Жуковка; глубокозалежное (7.6 м) евтрофное болото; кедровник елово-лиственнич-но-пихтовый разнотравно-гип-новый 4К2Е1.5Л1П0.5С1Б 30 2-4 4-6 36-52
К-4 56°53' с.ш., 82°40' в.д. Междуречье Иксы и Бакчара; глубокозалежный (2.7 м) олиго-трофный массив; сосняк сфаг-ново-кустарничково-пушице-вый в сочетании с куртинами и одиночными деревьями кедра 8С2К ед. Б 30 4-7 11-16 92-211
суходольных экотопах южно-таежной подзоны Западной Сибири, интегрированных в единый лесоболотный экологический профиль [9].
Очевидно, что полученные к настоящему времени данные по сравнительному анализу морфо-физиологических признаков репродуктивной сферы, цитогенетических параметров, а также полиморфизма белок-кодирующих последовательностей (изоферментов) болотных и суходольных популяций сосны кедровой сибирской немногочисленны и достоверно диагностируют лишь их экотопическую дивергенцию, оставляя открытым вопрос о возможной генетической дифференциации на уровне непосредственного носителя наследственной информации — ДНК. В настоящей работе приводятся качественно новые данные по оценке генетической изменчивости, структуре и дифференциации популяций Р. $1Ыг1-са, произрастающих в болотных и суходольных экотопах южно-таежной подзоны Западной Сибири, основанные на исследовании полиморфизма ДНК с использованием маркеров ядерного генома (88Я-маркеры). Достоинством микросател-литного анализа является большое число локусов (независимых маркеров) и аллелей, высокий уровень полиморфизма, кодоминантность, что позволяет легко идентифицировать гомозиготные и гетерозиготные генотипы. Все эти качества 88Я-маркеров делают их высокоинформативными и
удобными для изучения генетической структуры и дифференциации исследуемых популяций.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования послужили выборки из четырех популяций сосны кедровой сибирской. Краткая характеристика популяций и их местоположение представлены в табл. 1.
ПЦР-анализ проводили на базе филиала ФБУ "Российский центр защиты леса", г. Красноярск. Индивидуальные препараты тотальной ДНК выделены из 100—200 мг высушенной хвои, собранной с 30 деревьев в каждой из четырех популяций (всего 120 образцов). ДНК выделяли по протоколу для растительных тканей с применением цетил-триметиламмониумбромида (СТАВ-метод) [19].
В качестве генетических маркеров в работе использовали ядерные микросателлитные локусы (фрагменты ДНК с повторяющимися короткими нуклеотидными последовательностями). Выделенную ДНК использовали для проведения ПЦР с шестью парами праймеров (табл. 2), разработанных для сосны кедровой европейской (Ртш сетЬга L.) и успешно апробированных для работы с Р. зШпса [20]. Это обусловило выбор данных праймеров для использования в настоящей работе. Характеристики отобранных для исследова-
Таблица 2. Характеристика ядерных микросателлитных локусов, отобранных для анализа генетической изменчивости Р. зШпеа
Локус Мотив Температура отжига, °С Размер фрагмента, пн Na
Pc 1b (GT)19 54 174-212 9
Pc 7 (CT)6(AT)4(GT)25 54 354-378 5
Pc 18 (TG)12 54 152-158 4
Pc 22 (CA)7TA(CA)12(TA)2 54 342-354 6
Pc 23 (TG)6CG(TG)2 54 205-235 4
Pc 35 (GTT)7 54 152-162 2
Примечание. Na - среднее число аллелей на локус.
ний ядерных микросателлитных локусов также приведены в табл. 2.
Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали набор реагентов для амплификации ДНК GenePak PCR Core ООО "Лаборатория Изо-ген". Амплификацию отобранных ядерных микросателлитных локусов проводили при следующем режиме: предварительная денатурация ДНК 94°C — 15 мин; далее 30 циклов, включающие 30 с плавления при 94°C, отжиг праймеров 30 с при 54°C и 50 с элонгации при 72°C. Завершающий цикл элонгации проходил при 72°C в течение 15 мин.
Электрофоретическое разделение амплифи-цированных фрагментов ДНК проводили в 6%-ном полиакриламидном геле с использованием Трис-ЕЭТЛ-боратного электродного буфера в камерах для вертикального электрофореза при напряжении 300 В в течение 2—2.5 ч. Окрашивание гелей проводили раствором бромистого этидия с дальнейшей визуализацией продуктов амплификации в УФ-свете. В качестве маркеров стандартных длин использовали ДНК плазмиды pBR322, обработанные рестриктазами HaeIII и HpaII.
Для выявления и исключения возможных вариантов ошибок генотипирования микросател-литных локусов, связанных в подобных исследованиях главным образом с возникновением скрытых нуль-аллелей в гомозиготах, которые возникают вследствие мутации ДНК в зоне гибридизации праймера или за счет неполного сродства праймеров, была использована программа MICRO-CHECKER [21]. При помощи данной программы провели оценку частот возможных нуль-аллелей в локусах и скорректировали число гомозиготных генотипов, а также частоту амплифицированных аллелей в популяциях. Исправленные генотипы четырех исследованных популяций сосны кедровой сибирской в дальнейшем были использованы для проведения расчета основных показателей внутри- и межпопуляци-онной генетической изменчивости с помощью программы GenAlEx 6.41 [22]. Для анализа связи между географическими и генетическими расстояниями использовали тест Мантела [23].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ шести ядерных микросателлитных ло
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.