Ш БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 3, с. 259-274
ОБЗОРНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.213:088.5+577.333'2
ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СЕНСОРЫ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
© 2015 г. Д. С. Билан*- **, #, С. А. Лукьянов*, **, В. В. Белоусов*, **
* ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **ГБОУВПО "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации, 603005, Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, 10/1 Поступила в редакцию 03.09.2014. Принята к печати 10.10.2014 г.
Окислительно-восстановительные процессы играют ключевую роль в клетках любых организмов. Эти процессы подразумевают направленные потоки электронов, в переносе которых участвуют ре-докс-пары: соединения, представленные в клетке параллельно в окисленном и восстановленном состояниях, например, МАБ+^АБН, МАБР+^АБРН, До недавнего времени изуче-
ние окислительно-восстановительных процессов в живых клетках было затруднено, что было связано с отсутствием подходящих методов. Генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры представляют собой новый инструмент для изучения биологических процессов, в том числе окислительно-восстановительных. Биосенсоры позволяют в режиме реального времени регистрировать мессенджеры, метаболиты и активность ферментов в живых системах различной сложности, от культивируемых клеток до трансгенных животных. В обзоре рассмотрены основные типы известных редокс-биосенсоров и примеры их использования.
Ключевые слова: генетически кодируемые флуоресцентныередокс-биосенсоры, активные формы кислорода, 20БН/0ББ0, МЛП+/ЫЛПН.
БОТ: 10.7868/80132342315020037
ВВЕДЕНИЕ
Открытие и клонирование гена зеленого флуоресцентного белка (GFP) [1—4], исходно выделенного из медузы Aequorea victoria, и обнаружен-
Сокращения: АФК — активные формы кислорода; NAD+/NADH — никотинамидадениндинуклеотид окисленный/восстановленный; NADP+/NADPH — никотинамид-адениндинуклеотидфосфат окисленный/восстановленный; GSH/GSSG — глутатион восстановленный/окисленный (глутатиондисульфид); GFP — зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein); roGFP — редокс-активный зеленый флуоресцентный белок (redox green fluorescent protein); EYFP и ECFP — улучшенные желтый и циановый флуоресцентные белки (enhanced yellow/cyan fluorescent protein); cpmTS — круговой пермутант T-Sapphire (circularly permutated T-Sapphire); cpYFP — круговой пермутант желтого флуоресцентного белка YFP (circularly permutated yellow fluorescent protein); rxYFP — редокс-активный желтый флуоресцентный белок (redox yellow fluorescent protein); Akt — протеинкиназа B; CRD — цистеинбогатый домен (cysteine-reach domain); EGF — эпидермальный фактор роста (epidermal growth factor); FRET — Фёрстеровский резонансный перенос энергии (Förster resonance energy transfer); Grx — глутаредоксин (glutaredoxin); NGF — фактор роста нервов (nerve growth factor); OxyR-RD — регуляторный домен транскрипционного фактора OxyR; PDGF — тромбоцитар-ный фактор роста (platelets derived growth factor); PI3K — фосфатидилинозитол-3-киназа; PTP-1B — тирозинфосфа-таза 1B; wtOxyR — бактериальный белок OxyR дикого типа. # Автор для связи (тел.: +7(499) 724-84-66; эл. почта: d.s.bilan@gmail.com).
ные позже ОБР-подобные белки из других источников, позволили создать совершенно новые подходы для исследований биологических процессов, как на клеточном, так и на молекулярном уровне. К настоящему времени методами генной инженерии получено большое количество ОБР-подобных белков, которые отличаются от белков дикого типа стабильностью, величиной квантового выхода, временем созревания хромофора и спектральными характеристиками [5]. ОБР-подобные белки широко применяются для изучения экспрессии генов, взаимодействий и локализации всевозможных молекул в живых клетках.
На основе флуоресцентных белков регулярно создаются генетически кодируемые биосенсоры, позволяющие исследовать протекание различных клеточных реакций и процессов в живых системах. Биосенсоры подобного типа приобретают все большую популярность по сравнению с синтетическими индикаторами. Главное их преимущество заключается в возможности их использования в живых целостных системах — как на клеточном уровне, так и на уровне целого организма. Кроме того, биосенсоры на основе флуоресцентных белков более фотостабильны и менее токсичны для клетки в сравнении со своими синтетическими аналогами.
N C
Круговая пермутация
N
C
Рис. 1. Получение кругового пермутанта флуоресцентного белка YFP.
Изучение окислительно-восстановительных процессов в живых системах в режиме реального времени долгое время было затруднено или невозможно вовсе, главным образом, из-за отсутствия подходящих методов. Для регистрации некоторых видов активных форм кислорода (АФК) существуют различные синтетические красители. Применение некоторых из этих красителей возможно лишь в условиях in vitro. Красители, способные проникать внутрь клеток, как правило, не являются специфичными, а их реакции необратимы. Кроме того, на сигналы таких индикаторов часто накладываются артефакты, связанные с наличием побочных реакций [6—16]. Полностью отсутствовали методы, позволяющие регистрировать в живых моделях и другие компоненты окислительно-восстановительных процессов, в том числе так называемые активные редокс-пары клетки, такие как NAD+/NADH, GSSG/2GSH.
Многие проблемы детекции редокс-активных соединений были решены благодаря созданию генетически кодируемых редокс-биосенсоров на основе флуоресцентных белков. Уже прошло несколько лет с момента создания первых таких индикаторов, за это время они были протестированы на большом количестве биологических моделей разного уровня сложности, от клеток в культуре до трансгенных животных.
БИОСЕНСОР НА ПЕРОКСИД ВОДОРОДА HyPer
Генетически кодируемый флуоресцентный ре-докс-биосенсор HyPer позволяет специфично исследовать роль молекулы Н2О2 в процессах, происходящих в живых клетках и их компартментах [17]. В основе структуры этого биосенсора лежит транскрипционный фактор E. coli OxyR. В бактериальной клетке белок OxyR специфично активирует экспрессию ряда генов в ответ даже на небольшое увеличение концентрации Н2О2. В присутствии Н2О2 в регуляторном домене OxyR происходит образование дисульфидной связи между цистеиновыми остатками Cys-199 и Cys-208 [18, 19]. Высокая реакционная способность Cys-199 в отношении Н2О2 (константа скорости
реакции составляет 105—107 М-1 с-1) обусловлена низким значением рКа его тиоловой группы [20, 21]. Гидрофобное окружение Суз-199 ограничивает доступ заряженных оксидантов к этому остатку, например, супероксид-анион радикала. При взаимодействии с амфифильной молекулой Н2О2 тиоловая группа Суз-199 окисляется до сульфено-вой кислоты, после чего окисленный аминокислотный остаток уходит из своего гидрофобного окружения и сближается с Суз-208 с формированием дисульфидной связи, что приводит к кон-формационным изменениям всей структуры белка [18].
Для получения биосенсора НуРег, регистрирующего Н2О2, в регуляторный домен ОхуЯ через короткие пептидные линкеры был внедрен круговой пермутант желтого флуоресцентного белка (срУБР) (схема срУБР изображена на рис. 1). Создание пермутированных ОБР-подобных белков необходимо для увеличения подвижности хромофорного окружения и, следовательно, для большей лабильности спектральных свойств флуоресцентных белков. В первичную структуру ОБР-подобного белка на уровне гена вносится разрыв в область между 144-м и 149-м аминокислотными остатками, нативные N и С-концы совмещаются при помощи полипептидного линкера. Новые N и С- концы находятся в непосредственной близости от хромофора и могут влиять на его микроокружение.
В составе химерного белка НуРег (ОхуЯ-срУБР) регуляторный домен ОхуЯ (ОхуЯ-ЯЭ) также отвечает за реакцию с Н2О2, как и в белке дикого типа 'ЮхуЯ. В результате окисления НуРег при взаимодействии с Н2О2 происходят конформационные изменения регуляторного домена ОхуЯ-ЯЭ, передающиеся на структуру срУБР [17] (рис. 2а).
Для НуРег характерно наличие двух пиков возбуждения флуоресценции с максимумами при 420 нм и 500 нм, при окислении биосенсора в его спектре возбуждения флуоресценции происходит пропорциональное увеличение интенсивности при 500 нм и уменьшение интенсивности при 420 нм (рис. 2б). Максимум эмиссии флуоресценции фиксируется при 516 нм [17]. Микроскопию клеток, экспрессирующих НуРег, осуществляют в двух каналах. Сигнал биосенсора определяют как соотношение интенсивностей флуоресценции, отдельно возбуждаемой при 500 и 420 нм (Б500/Б420) (рис. 2в, г). Рациометрические показания сигнала НуРег (Б500/Б420) позволяют избежать многих артефактов микроскопии, вызванных движениями объекта или разными уровнями экспрессии биосенсора между клетками и их ком-партментами.
Сигнал НуРег обратим, поскольку, как и в случае окисленного 'ЮхуЯ, биосенсор может быть восстановлен тиол-восстанавливающими систе-
cpYFP
OxyR-RD
V ^
SH
H2O2
OxyR-
-RD
SH
F420
Grx
в
F500
F500/F420
После добавления H2O2:
«250 е
Е 200
о д"
S 150 о вн
сив100
нс е
IS 50 И
400 420 440 460 480 500 520 Длина волны, нм
г
mm
4 6 Время, мин
Рис. 2. Генетически кодируемый флуоресцентный биосенсор HyPer. (а) Схема строения HyPer и его обратимая реакция окисления. При взаимодействии HyPer с Н2О2 происходит формирование дисульфидной связи в регуляторном домене OxyR (OxyR-RD), конформационные изменения которого передаются на флуоресцентный белок cpYFP. Тиол-восстанавливающие системы клетки обратно восстанавливают HyPer. (б) Спектр возбуждения флуоресценции полностью восстановленного HyPer (штрихпунктирная линия) и полностью окисленного HyPer (сплошная линия). Для спектра характерно наличие двух пиков с максимумами при 420 и 500 нм, изменяющихся рациометрически. (в) Клетки линии HeLa Kyoto, экспрессирующие HyPer, до добавления (верхний ряд) и спустя 1 мин после добавления Н2О2 до конечной концентрации 100 мкМ (нижний ряд). Флуоресценцию клеток регистрируют в двух каналах F420 и F500, соответств
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.