ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 10, с. 1222-1231
ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА
УДК 575.22
ГЕНЕТИЧЕСКИ ОБУСЛОВЛЕННОЕ ОГРАНИЧЕНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЛЕТОК HaCaT В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ПСОРИАЗА
© 2014 г. А. Г. Соболева, А. Д. Золотаренко, В. В. Соболев, С. А. Брускин,
Э. С. Пирузян, А. В. Мезенцев
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 e-mail: mesentsev@vigg.ru, sergey.bruskin@gmail.com Поступила в редакцию 29.01.2014 г.
Провоспалительные цитокины: фактор некроза опухолей (ФНО), интерферон у (ИФНГ) и интер-лейкин 17 (ИЛ-17) — играют важную роль в патогенезе псориаза. Активация эпидермальных кера-тиноцитов этими цитокинами изменяет процесс дифференцировки клеток, что является основной причиной их гиперпролиферации в коже больных. Иммортализованную линию кератиноцитов человека HaCaT часто используют в качестве модельной системы для изучения молекулярных механизмов патогенеза псориаза. Установлено, что обработка клеток HaCaT провоспалительными цитокинами приводит к снижению пролиферации этих клеток. Анализ генной экспрессии выявил группу из 12 генов, экспрессия которых повышена при псориазе, но снижена в клетках HaCaT после их обработки цитокинами. Выявленные гены играют важную роль в процессе репликации ДНК и входят в состав двух других, более обширных групп генов с измененной экспрессией, участвующих в регуляции клеточного цикла. Полученные в ходе данной работы результаты свидетельствуют о том, что культура клеток HaCaT имеет существенное ограничение в качестве модельной системы псориаза: обработка HaCaT провоспалительными цитокинами не приводит к увеличению пролиферации клеток. Эту особенность необходимо принимать во внимание при изучении влияния новых лекарственных препаратов на пролиферацию клеток.
DOI: 10.7868/S0016675814100130
Псориаз является одним из наиболее социально значимых заболеваний. Согласно статистическим данным, примерно 2—3% от общего населения планеты [1] болеют псориазом. Частота заболевания псориазом варьирует в широких пределах — от 0.91% в Соединенных Штатах до примерно 8.5% в Норвегии [2]. В средней полосе России псориазом болеют около 1—2% населения [3]. В настоящее время причины, вызывающие псориаз, не ясны и лекарств, ведущих к полному излечению от псориаза, пока нет. В силу этого изучение патогенеза псориаза является важной и актуальной задачей.
Известно, что ключевыми клетками патогенеза псориаза являются клетки иммунной системы. В пораженной псориазом коже провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухолей (ФНО), интерферон у (ИФНГ) и интерлейкин 17 (ИЛ-17), активируют эпидермальные кератиноци-ты [4]. Это, в свою очередь, приводит к изменениям в программе дифференцировки данного типа клеток и увеличению их пролиферации.
Для изучения молекулярных основ псориаза широко применяется моделирование [5—7]. Экспериментальные модели псориаза позволяют изучать развитие патологического процесса в контролируемых условиях, т.е. тестировать новые подходы к лечению болезни до начала клиниче-
ских испытаний, а также быстро и качественно проводить отбор новых лекарств из сравнительно большой подборки предлагаемых экспериментальных препаратов. К настоящему времени в качестве экспериментальных моделей для изучения псориаза используют культуры клеток, а также лабораторных животных. Помимо этого, существуют трехмерные модели кожи человека, т.е. ее искусственные имитации, созданные в лаборатории из одного или нескольких типов клеток, наработанных предварительно in vitro.
В качестве экспериментальной модели для изучения псориаза часто используют иммортализованную линию кератиноцитов человека HaCaT [8—10]. Как у экспериментальной модели, у HaCaT есть ряд преимуществ и перед нормальными эпидермальными кератиноцитами человека (НЭКЧ), и перед клеточными линиями, полученными методом вирусной трансформации. В отличие от НЭКЧ, HaCaT легче культивировать in vitro. Данные клетки не требуют добавления в среду дополнительных ростовых факторов. Кроме этого, не требуется поддержания в среде низкой концентрации ионов кальция. Пересадка HaCaT животным, в отличие от многих других клеточных линий, не приводит к образованию опухолей, а сами клетки нормально проходят процесс дифференцировки [11]. С другой стороны, у пересажен-
ных клеток, в отличие от окружающих их клеток животного, наблюдается паракератоз (задержка в деградации клеточных ядер), который является одним из характерных признаков псориаза.
Несмотря на частое использование HaCaT в качестве экспериментальной модели псориаза, до сих пор не было проведено количественной оценки влияния провоспалительных цитокинов на пролиферацию этих клеток. В представляемой работе мы установили, что при обработке HaCaT провоспалительными цитокинами ФНО, ИФНГ и ИЛ-17 у данного типа клеток не происходит увеличения их пролиферации. Для объяснения этого факта и выявления дифференциально экспресси-рующихся генов в клетках HaCaT, обработанных цитокинами, а также в образцах кожи, пораженной и не пораженной псориазом, были использованы данные экспрессионных микрочипов, размещенные в депозитарии Gene Expression Omnibus. Анализ изменений генной экспрессии выявил группу из 12 генов, большинство из которых непосредственно участвуют в процессе репликации ДНК. Экспрессия этих генов снижена в клетках HaCaT, обработанных ФНО, ИФНГ и ИЛ-17, но при этом увеличена в пораженной псориазом коже. Соответственно, подавление экспрессии этих генов может быть основной причиной того, что в HaCaT снижается пролиферация в ответ на обработку провоспалительными цитокинами. Таким образом, если рассматривать HaCaT в качестве экспериментальной модели псориаза, то необходимо отметить, что данная модель имеет существенное ограничение. Это ограничение — снижение пролиферации HaCaT в ответ на обработку ФНО, ИФНГ и ИЛ-17 — следует принимать во внимание при выборе модельной системы для изучения влияния на пролиферацию эпидер-мальных клеток новых экспериментальных препаратов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение эпидермальных кератиноцитов человека. Эпидермальные кератиноциты человека получали из образцов кожи, оставшихся невостребованными в косметическом салоне. В работе использовали ткань шести здоровых доноров. Образцы ткани обеззараживали бетадином, а затем последовательно промывали 70%-ным этанолом, гентамицином и изотоническим фосфатным буферным раствором PBS. После этого с кусочков кожи срезали слой жировой ткани и оставляли их на ночь в растворе диспазы (Sigma-Aldrich, США) при 4°С. Концентрация диспазы составляла 0.5 мг/мл. На следующее утро эпидермис отделяли от дермы при помощи пинцета и измельчали ножницами. Измельченный эпидермис инкубировали в среде KSFM (Life Technologies, США) при медленном перемешивании в течение 30 мин.
По окончании инкубации суспензию клеток фильтровали через сито с размером ячеек 70 мкм (Sigma-Aldrich, США). Полученный фильтрат центрифугировали (250 g, 5 мин). Осадок, состоявший из осевших клеток, ресуспендировали в небольшом объеме среды EpiLife. После этого определяли количество клеток в суспензии, используя камеру Горяева. Выделенные клетки пересевали на пластиковые чашки (Sigma-Aldrich, США) из расчета 1.1 х 104 клеток/см2. Данный протокол был утвержден комитетом по этике Института общей генетики РАН им. Н.И. Вавилова. Настоящий протокол соответствует принципам Хельсинкской декларации и Российскому законодательству, регулирующему работу с донорской тканью.
Культивирование клеток. Клетки HaCaT культивировали в среде ДМЕМ, которая содержала L-глутамин, 10%-ную эмбриональную сыворотку теленка (ПанЭко, Россия), а также 1%-ный раствор антибиотика—антимикотика (Invitrogen, США). НЭКЧ (нормальные эпидермальные ке-ратиноциты человека) культивировали в среде EpiLife (Life technologies, США), которая содержала 1%-ный раствор антибиотика—антимикотика (In-vitrogen, США), а также коммерческую добавку S7 (Invitrogen, США). Для культивирования НЭКЧ использовали культуральную посуду с покрытием из коллагена первого типа (Sigma-Aldrich, США). Использование коллагена необходимо для более эффективного прикрепления клеток и их последующего роста. Концентрацию кальция в среде EpiLife поддерживали на уровне 60 мкМ. Низкая концентрация кальция в среде необходима для предотвращения дифференцировки клеток. На следующее утро неприкрепившиеся клетки удаляли при смене среды. Трехмерные модели кожи из HaCaT и НЭКЧ получали, как описано ранее [12].
Количественная оценка пролиферации клеток. Для количественной оценки пролиферации в 6-луночные планшеты высевали 40000 клеток на лунку. Каждый второй день после посева в культу-ральную среду добавляли либо ИЛ-17 (50 нг/мл), либо комбинацию двух цитокинов: ФНО и ИФНГ (50 нг/мл каждого). На следующее после добавления цитокинов утро случайно выбранные образцы обрабатывали трипсином, после чего в них определяли количество клеток.
Данные о количестве клеток в образцах использовали для построения кривых роста. Результаты представляли в линейных и полулогарифмических координатах. Данные, представленные в полулогарифмических координатах, обрабатывали статистически с использованием метода линейной регрессии. Величины углов наклона (a) полученных таким образом линейных моделей использовали в качестве количественной оценки
пролиферации клеток. Каждый эксперимент повторяли трижды.
Получение препаратов РНК. Для выделения РНК из клеток использовали TRIZOL. Выделение проводили согласно ранее описанному протоколу [13]. По окончании выделения поглощение в полученных растворах РНК определяли спектрофотомет-рически. Качество препаратов РНК проверяли методом электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле в неденатурирующих условиях.
Количественная ПЦР. Из образцов выделенной РНК получали кДНК, используя набор реагентов MMLV RT (Евроген, Россия). Полученные образцы кДНК анализировали методом количественной ПЦР. В эксперименте использовали коммерческие праймеры выбранных генов (Life technologies, США). Эксперимент проводили на приборе Eco (Illumina, США). В качестве эндогенного контроля использовали данные об экспрессии гена ACTB (Cat # 433376
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.