ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 7, с. 853-861
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.17:597.442
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СУДАКА Sander lucioperca (Linnaeus, 1758) И БЕРША Sander volgensis (Gmelin, 1789) РЫБОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ВОДОЕМОВ КАЗАХСТАНА
© 2014 г. А. Е. Барминцева1, Г. М. Шалгимбаева2, С. К. Койшыбаева2, Ш. Т. Сарбаканова3,
С. Ж. Асылбекова2, К. Б. Исбеков2, Н. С. Мюге1
1Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, Москва 107140
e-mail: bae69@mail.ru
2Казахский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства, Алматы 050016
e-mail: shalgimbayeva@mail.ru 3Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт, Алматы 050016
e-mail: sholpan.sar@mail.ru Поступила в редакцию 12.12.2013 г.
Представлены результаты исследования генетического полиморфизма нескольких популяций судака Sander lucioperca, собранных на территории республики Казахстан (оз. Балхаш, р. Урал, р. Сыр-дарья и Шардара, Малый Арал), а также из р. Волга, и берша Sander volgensis (оз. Балхаш, р. Волга) по шести микросателлитным локусам и гену цитохрома b митохондриальной ДНК. Все исследованные локусы амплифицируются у обоих видов, дают совершенно разные диапазоны аллелей, что позволяет использовать их для четкой видовой идентификации судака и берша. С другой стороны, ни по ядерным, ни по митоходриальным маркерам значимой дифференциации между исследованными выборками судака не было обнаружено, за исключением некоторой обособленности популяции из р. Волга.
DOI: 10.7868/S0016675814070042
Судак Sander lucioperca и берш Sander volgensis относятся к отряду окунеобразных Perciformes, семейству окуневых Percidae, роду судак Sander. Судак распространен в бассейнах Балтийского, Черного, Азовского, Каспийского и Аральского морей [1, 2]. Берш обитает в пределах ареала судака, но ограничен бассейнами среднего и нижнего течения рек, впадающих в северные части Черного, Азовского и Каспийского морей [2, 3].
Естественным ареалом обитания судака и берша в Казахстане является Урало-Каспийский бассейн: р. Урал с ее притоками и пойменными озерами, а также Каспийское озеро до изогалины 7— 9%. В бассейне Северного Каспия судак образует два стада: волжское и уральское, которые частично смешиваются благодаря перекрывающемуся ареалу и внешне не различаются [4].
В Арало-Сырдарьинском бассейне судак населял Аральское море до конца 70-х годов ХХ в. и оставался промысловым видом, выдерживая при этом высокую (до 18%) соленость воды. К 1984 г., когда соленость превысила 18%, Аральское море полностью потеряло рыбохозяйственное значение, выловы судака старших возрастов наблюдались лишь в устье р. Сырдарья [5].
После массовой акклиматизации судака в 1960—70-е гг. в новые для него водоемы (озера
Балхаш, Алаколь, реки Иртыш, Талас и Нура) ареал его обитания быстро расширился, и в настоящее время судак полностью натурализовался и стал объектом промысла. Успех акклиматизации был достигнут за счет неоднократных вселений разновозрастных половозрелых рыб. Вселение рыб происходило из р. Урал и низовья р. Сырдарья [4]. Берш же был случайным вселенцем в оз. Балхаш при акклиматизации судака и на современном этапе считается, что в бассейне озера существуют две обособленные популяции берша: речная и озерная [6].
В последние годы именно судак в Казахстане является наиболее коммерчески ценным видом рыб и основным объектом экспорта.
Вследствие интенсивного промысла наблюдается падение численности судака, его размерно-весовых показателей, нарушение возрастной структуры рыб и сокращение числа половозрелых самок. Для сохранения высоких показателей уловов, поддержания численности и эффективного проведения искусственного воспроизводства судака необходимы знания о его генетической структуре и природном полиморфизме в основных рыбохозяйственных водоемах Казахстана.
Генетические исследования судака и берша в Казахстане проводились в середине 90-х годов
Таблица 1. Исследованные выборки судака и берша
Вид Место вылова Количество, шт. Дата вылова
Судак Малое Аральское море, Казахстан 44 2012-13 гг.
р. Урал (г. Уральск), Казахстан 32 2012 г.
р. Урал (г. Атырау), Казахстан 39 2012 г.
р. Волга (г. Астрахань), Россия 37 2012 г.
оз. Балхаш (запад), Казахстан 12 2013 г.
оз. Балхаш (восток), Казахстан 12 2013 г.
р. Сырдарья, Казахстан 8 2013 г.
Водохран. Шардара, Казахстан 12 2013 г.
Итого 196
Берш оз. Балхаш (запад), Казахстан 12 2013 г.
оз. Балхаш (восток), Казахстан 12 2013 г.
р. Волга (г. Астрахань), Россия 2 2013 г.
Итого 26
Всего 222
ХХ столетия на основе метода ДНК-гибридизации и был предположен гибридный статус берша в оз. Балхаш [7]. Также высказывалось предположение, что берш является, возможно, "прибрежной, или "камышевой", формой судака" [8].
Современные генетические исследования судака на европейской территории с использованием последовательности гена CytB показали его генетическую однородность [9], а изучение родственных отношений американских и европейских видов внутри рода Sander на основании анализа последовательности двух митохондриальных и двух ядерных генов показало сестринское, но в то же время достаточно обособленное положение берша, обыкновенного и морского (S. marinus (Cuvier, 1828)) судаков [10].
Задача настоящего исследования — сравнительный анализ двух нативных, Урало-Каспийской и Арало-Сырдарьинской, а также интроду-цированной Балхаш-Илийской популяций судака с целью определения степени генетической дифференциации этих популяций, а также уточнения вопроса о возможной природной гибридизации судака и совместно обитающего с ним близкородственного вида — берша.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовались сборы генетического материала судака и берша 2012—2013 г., проведенные на территории Казахстана: оз. Балхаш (западная и восточная часть), р. Сырдарья от Малого Аральского моря до Шардаринского водохранилища и р. Урал (нижние тоневые участки Нижняя Пешнойская и Еркин-Калинская и среднее тече-
ние в районе г. Уральска), а также выборка проходного судака из низовьев р. Волга.
Пробы судака и берша отбирались прижизненно путем отрезания фрагмента грудного плавника с последующей фиксацией в 96%-ном этиловом спирте на местах сбора материала. Всего было проанализировано 222 особи — 196 проб судака и 26 проб берша (места сбора материала представлены в табл. 1).
Выделение и последующую очистку ДНК проводили методом абсорбции на колонках (PALL) [11] c контролем качества выделения на спектрофотометре SPECTRAmax PLUS 384. ДНК хранили при температуре —20°С до использования.
Микросателлитный анализ. Для анализа полиморфизма различных популяций судака и берша были отобраны 6 пар микросателлитных локусов из ранее опубликованных для этого вида [12, 13] (табл. 2).
Реакции амплификации проводили в конечном объеме 15 мкл (70 мМ трис-HCl (pH 8.6); 16.6 мМ (NH4)2SO4; 1.8 мМ MgCl2; по 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата; 1 пМ праймера, модифицированного на 5'-конце флуоресцентным красителем FAM, HEX или TAMRA; 4 пМ обратного (не меченого) праймера; 50—100 нг ДНК-матрицы и 1.2 ед. Taq-полимера-зы ("Силекс")) по следующей схеме: предварительная денатурация ДНК: 94°С — 2 мин; 8 циклов: плавление — 90°С — 20 с, отжиг прайме-ров — 58°С в первом цикле — 25 с и в каждом последующем цикле температура отжига снижалась на 0.5°С до 54°С, синтез ДНК - 65°С - 40 с; 40 циклов: плавление — 90°С — 20 с, отжиг прай-
меров - 54°С - 25 с, синтез ДНК - 65°С - 40 с; досинтез ДНК при 70°С - 10 мин.
Полученную ПЦР смесь разбавляли milliQ Н2О до 115 мкл, затем по 1.2 мкл разбавленной реакционной смеси переносили в 12 мкл формами-да Hi-Di с добавленным молекулярным стандартом для определения размера амплифицируемых фрагментов ДНК.
Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили с помощью системы капиллярного электрофореза "ABI PRISM 3130 Genetic analyzer", определение длин аллелей осуществляли с использованием программного обеспечения GeneMarker (Version 1.2). Статистическую обработку и определение вероятности принадлежности особей к каждой из предполагаемых популяций (видов) проводили в программах GenAlex [14] и Structure 2.3.3 [15]. Оценка достоверности значений FST проводилась с использованием программы Genepop [16].
Анализ митохондриальной ДНК проводили на амплификаторе "MJ Research PTC-225 Thermocy-cler" с использованием универсальных прайме-ров на Cyt B [17].
GluFish AACCACCgTTgTTATTCAACTACAA,
THRFish ACCTCCgATCTTCggATTACAAgACC.
ПЦР-реакции содержали ~100 нг ДНК и проводились в объеме 15 мкл (70 мМ трис-HCl (pH 8.3), 16.6 мМ (NH4)2SO4, 2 или 3 мМ MgCl2, по 100 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, по 1.5 пМ каждого из праймеров, 1 ед. ^^^hq-m-лимеразы "Силекс"). Амплификацию проводили по следующей схеме: предварительная денатурация ДНК: 95°C - 10 мин, синтез ПЦР-продуктов (30 циклов): плавление - 94°С - 20 с, отжиг прай-меров - 52°С - 40 с, синтез ДНК - 72°С - 60 с, окончательная достройка цепей: 72°С - 10 мин.
Результат амплификации проверялся методом электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.
Секвенирование проводилось с тех же праймеров на ABI PRISM 3130 с набором BigDye v. 1.1, далее анализировали и выравнивали полученные последовательности с помощью биоинформационного пакета программ LaserGene 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ митохондриальной ДНК
Нами получена последовательность 450 пн мтДНК по гену CytB у 72 особей судака из всех выборок и 26 особей берша. Полиморфизм в исследованных выборках судака не обнаружен, все последовательности являются идентичными, совпадающими с ранее опубликованной последовательностью судака (GenBank ref. № HM049965) [18] и с наиболее массовым в Европе гаплотипом A,
Таблица 2. Микросателлитные локусы, использованные в данной работе
Локус Праймеры 5'-3'
MSL3 F: FAM-CCGGCATCCATACACCTTAC
R: CACACCTGTGTCTGCCTAACA
MSL4 F: TAMRA-TCAAGACCCCAGAACCAATC
R: CAGACAGCTAAGAGAACAACAGG
MSL5 F: FAM-CAATCGCTCTGAGGATGTCA
R: AAGGGTGGGGAAATTATTCG
MSL7 F: HEX-CACACAGCAGCATGTGACAA
R: GGCACGGAGGTAGAATGGTA
Pfla L3 F: FAM-GCCGAATGTGATTGAATG
R: CGCTAAAGCCAACTTAATG
Yp1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.