МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 3, с. 407-415
ГЕНОМИКА.
ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 575.116.4:612.07:616-008.331.1
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЛОКУСЫ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ ВЕС СЕЛЕЗЕНКИ И УРОВЕНЬ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ, У КРЫС ЛИНИИ НИСАГ СО СТРЕСС-ЗАВИСИМОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ
© 2014 г. О. Е. Редина*, С. Э. Смоленская, Т. О. Абрамова, А. Л. Маркель
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090
Поступила в редакцию 30.08.2013 г.
Принята к печати 20.12.2013 г.
В последние два десятилетия показана важная роль иммунной системы в процессе развития гипертонии. Цель настоящей работы — генетическое картирование признаков "абсолютный вес селезенки" и "относительный вес селезенки" и сравнение обнаруженных нами локусов с локусами, которые описаны ранее для признаков "артериальное давление в покое и при стрессе". В качестве модельной системы использовали крыс линии НИСАГ с наследуемой артериальной гипертензией, индуцируемой стрессом. Изучали группу самцов-гибридов F2 (НИСАГ х WAG) в возрасте 6 мес., полученных при скрещивании гипер-тензивных крыс линии НИСАГ и нормотензивных крыс линии WAG. Впервые найден достоверный локус в дистальной части хромосомы 1 и пять вероятных локусов, ассоциированных с признаком "относительный вес селезенки", а также четыре вероятных локуса, ассоциированных с признаком "абсолютный вес селезенки". Достоверный локус на хромосоме 1 является общим для признаков "относительный вес селезенки", "уровень артериального давления в покое" и "уровень артериального давления при стрессе" у крыс линии НИСАГ. Развитие стресс-зависимой гипертензии у крыс этой линии может быть связано с изменением генетического контроля функции селезенки.
Ключевые слова: генетический контроль артериальной гипертензии, QTL-метод, абсолютный и относительный вес селезенки, крысы линии НИСАГ.
GENETIC LOCI FOR SPLEEN WEIGHT AND BLOOD PRESSURE IN ISIAH RATS WITH INHERITED STRESS-INDUCED ARTERIAL HYPERTENSION, by O. E. Redina*, S. E. Smolenskaya, T. O. Abra-mova, A. L. Markel (Institute of Cytology and Genetics, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia; *e-mail: oredina@ngs.ru). Recently, the important role of the spleen function in hypertension development was demonstrated. In this study, the genetic control of absolute and relative spleen weight was investigated to reveal the genetic loci common for spleen traits and for arterial blood pressure at rest and under the emotional stress conditions in the ISIAH rats with inherited stress-induced arterial hypertension. The search for genetic loci for absolute and relative spleen weight was performed on 6-month old F2 (ISIAH x WAG) hybrid males derived from a cross of hypertensive ISIAH and normotensive WAG rats. One significant QTL mapped on chromosome 1 and 5 suggestive loci were found for relative spleen weight. Four suggestive loci were detected for absolute spleen weight. All detected loci were novel. The significant QTL on chromosome 1 was common for relative spleen weight and arterial blood pressure at rest and under the emotional stress conditions in ISIAH rats. The results suggest that the manifestation of the stress-sensitive arterial hypertension in ISIAH rats may be related to the changes in genetic control of the spleen function.
Keywords: genetic control of arterial hypertension, QTL analysis, absolute and relative spleen weight, ISIAH rats.
DOI: 10.7868/S0026898414030161
Принятые сокращения: НИСАГ (ISIAH — Iinherited Stress-Induced Arterial Hypertension) — линия крыс с наследуемой, индуцируемой стрессом, артериальной гипертензией; WAG (Wistar Albino Glaxo) — линия крыс; SS (Salt Sensitive) — линия крыс с соль-зависимой гипертензией; SHR (Spontaneously Hypertensive Rats) — линия крыс со спонтанной гипертензией; АД — артериальное давление; QTL-анализ — Quantitative Trait Locus-анализ; ПЦР — полимеразная цепная реакция; ГГНС — гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система.
* Эл. почта: oredina@ngs.ru
В последние два десятилетия опубликовано много статей об участии иммунной системы в патогенезе артериальной гипертонии [1, 2]. Предполагается, что роль переключателя, который контролирует количество периферических ней-роэндокринных и иммунных медиаторов в крови и поддерживает тесную связь с центральным ответом на стресс через симпатическую иннервацию, выполняет селезенка [3]. Полагают также, что селезенка может быть источником вазоактив-ных факторов [4].
Артериальная гипертензия является фактором риска развития тяжелых сердечно-сосудистых заболеваний (инфаркта миокарда, церебрального инсульта и почечной недостаточности), однако молекулярно-генетические механизмы, контролирующие их развитие, изучены неполно [5]. Гипертоническая болезнь — широко распространенное, в подавляющем большинстве случаев полигенное, заболевание человека. Один из подходов для изучения генетической основы проявления полигенных признаков — метод QTL (Quantitative Trait Locus analysis) [6—8].
Для изучения механизмов развития стресс-чувствительной гипертензии в Институте цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) путем многолетней селекции получена линия крыс с наследуемой, индуцируемой стрессом, артериальной гипертензией (линия НИСАГ) [9]. В отличие от других гипертензивных линий, у крыс этой линии наиболее полно проявляется генетическая предрасположенность к гипертонии в условиях эмоционального стресса. Крысы линии НИСАГ отличаются от контрольных (нормотензивных) крыс линии Wistar Albino Glaxo (WAG) тем, что у них уровень артериального давления (АД) повышен как в покое, так и при стрессе, а масса сердца и почек увеличена [10]. Ранее при изучении крыс линии НИСАГ нами описаны генетические локу-сы, ассоциированные с АД в покое и при стрессе, а также с весом тела и абсолютным и относительным весом органов-мишеней — сердца, почек, надпочечников. Можно предположить, что в этих локусах находятся гены с плейотропным влиянием на вес органов-мишеней и уровень АД в покое и при стрессе, либо тесно сцепленные гены, влияющие на данные признаки [10, 11].
Участие иммунной системы в процессе развития гипертонии показано на экспериментальных моделях — крысах, характеризующихся соль-зависимой (SS) и спонтанной гипертензией (SHR) [12]. При изучении крыс линии SHR, обладающих повышенной активностью симпатической нервной системы, показана важная роль селезенки в развитии наблюдаемого у них иммунодефицита, а также взаимосвязь иммунной дисфункции с ги-пертензией [13, 14]. Повышение активности сим-пато-адреналовой системы у крыс линии НИСАГ
[15] также свидетельствует о том, что их селезенка может быть вовлечена в процесс развития гипертензии.
Относительный вес селезенки рассматривается как важный индекс для оценки неспецифического иммунитета [16]. У мышей генетическое картирование признака "вес селезенки" проводится наряду с определением локусов, детерминирующих вес сердца, печени, почек [17, 18]. На крысах QTL-ана-лиз для определения генетических локусов массы селезенки до настоящего времени не проводили.
Цель настоящей работы — генетическое картирование признаков "абсолютный вес селезенки" и "относительный вес селезенки" и сравнение выявленных локусов с описанными ранее локуса-ми признаков АД в покое и при стрессе у крыс линии НИСАГ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Животные. У шестимесячных крыс гипертен-зивной линии НИСАГ (n = 9) и нормотензивной линии WAG (Wistar Albino Glaxo) (n = 10) измеряли абсолютный и относительный (г/100 г веса тела) вес селезенки. Поиски генетических локусов, ассоциированных с весом селезенки, проводили на самцах-гибридах второго поколения F2 (НИСАГ х WAG) того же возраста (n = 103). Крыс содержали в стандартных условиях вивария Института цитологии и генетики СО РАН, вода и пища — без ограничения. Эксперименты выполняли в соответствии с Международными правилами ведения работ на экспериментальных животных. Данные по измерению уровня АД в покое и при стрессе у самцов F2 (НИСАГ х WAG) и анализ сцепления этих признаков описаны ранее [10].
ДНК выделяли из ткани печени с использованием протеиназы К и фенольной экстракции по стандартной методике [19], переосаждали этанолом и растворяли в деионизированной воде.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на геномной ДНК крыс проводили на амплификаторе "БИС" (ООО "БИС-Н", Кольцово, Россия) в 67 мМ буфере Трис-НС1, рН 8.9, содержащем 16 мМ (NH4)2SO4; 1.5 мМ MgC12; 0.01 % Tween 20; 10 мМ ß-меркаптоэтанол, 200 мкмоль каждого из четырех dNTP, 3 мкмоль каждого праймера, 50— 100 нг ДНК и 1 ед. фермента TaqI-ДНК-полиме-разы (ИЦиГ СО РАН, Новосибирск). Начальная денатурация — при 95° C в течение 5 мин, затем проводили 38 циклов амплификации по схеме: денатурация при 94° C — 20 с, отжиг праймеров — 15 с, элонгация при 72° C — 20 с, заключительная элонгация — 5 мин. Все амплифицируемые фрагменты были короче 300 оснований.
Электрофоретический анализ продуктов ПЦР проводили в 6%-ном полиакриламидном геле в Трис-боратном буфере (ТВЕ) при напряженности
10 В/см. Гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали с помощью гель-имиджера Biometra (Германия).
Для статистической обработки результатов использовали стандартные компьютерные программы Statistica 6.0 ("StatSoft, Tulsa", США). Достоверность различий между средними значениями оценивали с помощью i-критерия Стьюдента. Данные по весу тела, весу селезенки, уровню АД представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего арифметического.
Анализ сцепления. При выравнивании асимметрии распределения данных использовали логарифмирование. Для QTL-анализа использовали 149 полиморфных микросателлитных маркеров, список которых представлен на сайте Института цитологии и генетики СО РАН (http://icg.nsc.ru/isiah/category/ qtl/). Положение маркеров на хромосоме, выраженное в миллионах нуклеотидов (млн. н) от начала хромосомы, и последовательности прайме-ров определяли по базам данных Rat Genome Database (RGD) (http://rgd.mcw.edu/) и Ensembl (http://www.ensembl.org). Анализировали "пересечения" найденных локусов с известными локу-сами
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.