ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 5, с. 522-530
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 616.9:616-07
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ПРИЗНАКА РЕДУКЦИИ
НИТРАТОВ У ШТАММОВ Yersinia pestis
© 2014 г. Г. А. Ерошенко, Г. Н. Одиноков, Л. М. Куклева, Н. Ю. Шавина, Н. П. Гусева, В. В. Кутырев
Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб", Саратов 410005
e-mail: rusrapi@microbe.ru Поступила в редакцию 26.09.2013 г.
Проведено изучение генетических основ вариабельности признака редукции нитратов у штаммов различных биоваров и подвидов возбудителя чумы и показано, что причиной его отсутствия у различных внутривидовых групп Yersinia pestis являются мутации в разных генах, участвующих в экспрессии этого признака. Неспособность штаммов алтайского и гиссарского подвидов к проявлению денитрифицирующей активности вызвана не наличием мутации в позиции 613 гена napA пери-плазматической редуктазы, как у штаммов основного подвида средневекового биовара, а, по-видимому, мутацией в последовательности, кодирующей нитрат-связывающий домен ABC транспортного белка SsuA, в гене ssuA которого установлено присутствие вставки тимина (+Т) в позиции 302 от начала гена. Выявлено пять штаммов античного биовара, выделенных в различное время в Монголии, Китае и Африке, не способных к редукции нитратов. Разработана ПЦР на две ДНК мишени — участки хромосомной ДНК, содержащие делеции размером 19 и 24 пн, которая позволяет выявлять штаммы средневекового биовара. В комплексе с маркерной мутацией в гене napA она может быть использована для более надежной детекции штаммов Y. pestis этого биовара.
DOI: 10.7868/S001667581405004X
Штаммы Yersinia pestis — возбудителя особо опасной инфекционной болезни — чумы делятся на три биовара: античный, средневековый и восточный, каждый из которых был в свое время причиной трех пандемий чумы, прошедших в истории человечества в античные времена, в средние века и в современный период [1, 2]. Все три биовара относятся к основному подвиду Y. pestis, штаммы которого имеют высокую вирулентность и эпидемическую значимость и широко распространены в природных очагах на территориях различных континентов. В Российской Федерации наибольшее распространение имеют штаммы средневекового биовара, которые выделяются в большинстве природных очагов чумы, расположенных на ее территории. Кроме штаммов основного подвида в вид Y. pestis входят четыре неосновных подвида — кавказский, алтайский, гис-сарский и улегейский [3]. Штаммы неосновных подвидов имеют избирательную вирулентность для лабораторных животных (вирулентны для мышей, но слабо вирулентны для морских свинок) и распространены преимущественно в эндемичных очагах чумы в России и пограничных странах, где они персистируют на мелких грызунах и зайцеобразных [4]. Штаммы из двух природных очагов Китая, которые недавно было предложено выделить в отдельный биовар micro-tus, по комплексу их фенотипических и генетических особенностей также относятся к неоснов-
ным подвидам возбудителя чумы [5, 6]. Кроме того, известен единственный штамм неосновного подвида из Африки — Angola [7]. Как следует из сравнительного генетического анализа полногеномных последовательностей и отдельных участков генома, неосновные подвиды представляют собой древние формы чумного микроба, которые появились на ранних этапах эволюции Y. pestis и которые занимают промежуточное положение между предшественником — возбудителем псевдотуберкулеза и основным подвидом возбудителя чумы [6, 8, 9].
В основе деления штаммов Y. pestis на подвиды и биовары лежат различия в их биохимической активности. Все штаммы основного подвида в отличие от неосновных подвидов не способны ферментировать сахара — рамнозу и мелибиозу. Штаммы средневекового биовара не редуцируют нитраты, восточного — не ферментируют глицерин, а штаммы античного биовара положительны по обоим признакам. Штаммы трех неосновных подвидов — алтайского, гиссарского и улегейско-го, как и штаммы microtus, не редуцируют нитраты, на основании чего их часто ошибочно относят к средневековому биовару основного подвида.
Гены, кодирующие один из наиболее важных дифференциальных признаков — редукцию нитратов, собраны в nap оперон, включающий гены napA—D, napF и napP. Ранее было показано, что
причиной отсутствия денитрифицирующей активности у штаммов У. pestis средневекового биовара является мутация — замена единичного нук-леотида G —»- Т в позиции 613 гена napA пери-плазматической нитратредуктазы, которая приводит к смене триплета GAA —»- ТАА. Последний является стоп-кодоном и вызывает преждевременную терминацию трансляции полипептидной цепи молекулы периплазматиче-ской нитратредуктазы [5, 10, 11]. Штаммы шкго-Шз из Китая не редуцируют нитраты, однако мутация в позиции 613 гена napA у них отсутствует, в связи с чем высказано предположение о том, что в основе отсутствия признака у них лежит мутация в позиции 1021 гена napA — замена единичного нуклеотида G —► А [5]. Эти данные свидетельствуют о том, что отсутствие редукции нитратов у штаммов У. pestis может быть вызвано разными причинами, и, следовательно, использование только одного этого биохимического признака может приводить к ошибкам при определении внутривидового систематического положения штаммов У. pestis.
Целью нашей работы было изучение генетических основ вариабельности признака редукции нитратов у различных внутривидовых групп возбудителя чумы и разработка простого способа дифференциации штаммов У. pestis средневекового биовара на основе метода ПЦР.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы, условия культивирования. Штаммы, использованные в этой работе, представлены в табл. 1. Штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ "Микроб". Их культивирование проводили в бульоне и на агаре LB (рН 7.1—7.2) при 28°С в течение 24-48 ч.
Определение денитрифицирующей активности. В 1 мл бульона LB с 0.1% KNO3 помещали 108 клеток одно- или двухсуточной агаровой культуры У. pestis, инкубировали их при 28°С в течение 72 ч и затем добавляли в среду выращивания 0.5 мл реактива Грисса [12]. Появление розово-красного окрашивания бульона свидетельствовало о наличии у исследуемой бактериальной культуры денитрифицирующей активности, а его отсутствие -о неспособности этой культуры к редукции нитратов.
Ферментация глицерина. Способность к ферментации глицерина определяли в жидкой среде Гисса (1%-ная пептонная вода, рН 7.2, с 1%-ным глицерином и 1%-ным индикатором — бромти-моловым синим или индикатором Андреде). О наличии ферментативной активности у изучаемого штамма судили по изменению цветного
окрашивания среды после одного—трех дней его культивирования при 28°C [12].
ПЦР анализ и определение нуклеотидной последовательности. Использованные в работе прай-меры и условия проведения ПЦР представлены в табл. 2. Полученные в ПЦР продукты анализировали методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле при напряжении 10—15 В/см. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на секвенаторе Genetic Analyzer "CEQ 8000" (Beckman Coulter). Сравнительный анализ геномов бактерий выполняли с использованием нук-леотидных последовательностей штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Всего в работе было исследовано 177 штаммов Y. pestis, из которых 109 штаммов основного подвида получены в природных очагах России, других стран СНГ и Грузии в период с 1926 г. по 2012 г. (табл. 1), 32 штамма представляли мировую коллекцию и были выделены на территории различных континентов. Неосновные подвиды включали 36 штаммов из очагов России, Армении, Грузии, Таджикистана и Монголии. У всех этих штаммов было исследовано наличие способности к редукции нитратов (денитрифицирующей активности) и проведено секвенирование фрагмента гена napA размером 719 пн, включающего вариабельные нуклеотиды в позициях 613 и 1021.
Изучение признака редукции нитратов у штаммов Y. pestis основного подвида
Среди 109 штаммов основного подвида, изолированных на территории России и других стран СНГ в природных очагах чумы Кавказа, Закавказья и Прикаспия и в очагах Средней Азии, 83 штамма не обладали способностью к редукции нитратов и содержали характерную мутацию — замену нуклеотида G —»- Т в позиции 613 и, следовательно, относились к средневековому биовару. У этих штаммов наблюдалось соответствие между отсутствием денитрифицирующей активности и наличием маркерной мутации в гене napA. Мутация в гене napA в позиции 1021, описанная для штаммов microtus, у них отсутствовала (табл. 1).
Другие изученные 26 штаммов Y. pestis основного подвида из Тянь-Шаньских высокогорных очагов и очагов Сибири редуцировали нитраты и содержали ген napA дикого типа, в последовательности которого отсутствовали мутации в позициях 613 и 1021. Эти штаммы также ферментировали глицерин и, следовательно, по комплексу признаков относились к античному биовару.
16 из 32 изученных штаммов Y. pestis из мировой коллекции были также способны к редукции
Таблица 1. Использованные в работе штаммы Y. pestis и их характеристика
Штаммы, их происхождение Ферментация глицерина Редукция нитратов Нуклеотид в позиции гена napA Наличие делеций
613 1021 19 пн 24 пн
NCBI GenBank
CO92 биовар восточный - + G G - -
KIM10 биовар средневековый + - T G + +
Antiqua биовар античный + + G G - -
Nepal516 биовар античный + + G G - -
Harbin35 биовар средневековый + - G G - -
Pestoides F кавказский подвид + + G A - -
91001 microtus + - G A - -
Angola + + G A - -
Основной подвид Природные очаги России, других стран СНГ, Грузии
Очаги Сибири и Тянь-Шаньские + + G G - -
высокогорные очаги чумы, 1926—2012 гг., 26 штаммов (шт.)
Очаги Прикаспия, Кавказа, Закавказья и Средней Азии, 1930—2010 гг., 83 шт. + Т G + +
Основной подвид Мировая коллекция
231(14) Монголия, 1931 + - G G - -
235(21) Монголия, 1936 + - G G - -
239(25) Монголия, 1936 + - T G + +
И-3102 Монголия, 1984 + + G G - -
И-3244 Монголия, 1988 + + G G - -
4 Маньчжурия Китай, 1947 + + G G - -
199(290) Китай, 1935 + - T G + +
916(P-1) Китай, 1951 + + G G - -
Ku
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.