ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 2, с. 172-180
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 631.521:575.21:581.45:633.111
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОПУШЕНИЯ ЛИСТА У ИЗОГЕННЫХ ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ СОРТА НОВОСИБИРСКАЯ 67
© 2014 г. А. В. Дорошков1, Д. А. Афонников1*2, Т. А. Пшеничникова1
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090 2Новосибирский государственный университет, кафедра информационной биологии, Новосибирск 630090
e-mail: wheatpsh@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 23.04.2013 г.
Проведен генетический и моносомный анализ опушения листа изогенных линий мягкой пшеницы АНК 7А, АНК 7В и АНК 7С, созданных на основе сорта Новосибирская 67. Согласно данным визуального анализа сорт-реципиент имеет мягкое на ощупь, равномерное опушение, а линии несут на поверхности листа длинные упругие трихомы, унаследованные от двух китайских и одного советского сортов. Методом высокопроизводительного фенотипирования LHDetect2, позволяющего выделять фенотипические классы потомков в скрещиваниях на основе количественных характеристик опушения листа, было установлено, что хромосома 7B изогенных линий несет ген, определяющий наличие длинных трихом, а хромосома 7D сорта Новосибирская 67 несет ген, увеличивающий плотность опушения. Полученные данные позволили сформулировать гипотезу о наличии го-меаллельной серии генов, контролирующих опушение листа в хромосомах седьмой гомеологической группы мягкой пшеницы.
DOI: 10.7868/S0016675813120023
Опушение листа пшеницы Triticum aestivum L. представлено неветвящимися несекретирующи-ми трихомами. Наличие форм с опушенными органами у этой сельскохозяйственной культуры отмечалось еще Н.И. Вавиловым [1]. На основании тактильной и визуальной оценки опушение листа было отнесено к ряду групп: мохнатое, бархатистое, реснитчатое, редкое, шероховатое и т.п. При этом Н.И. Вавиловым отмечался преобладающий вклад генетической составляющей, по сравнению с условиями среды, в формирование этого признака, а также его внутривидовая вариация [2]. Различные формы опушения листа были обнаружены как для диплоидных пшениц (T. urartu, T. boeoticum, T. monococcum, Ae. spel-toides, Ae. squarrosa), так и для тетраплоидных (T. dicoccoides, T. dicoccum, T. durum, T. araraticum, T. timopheevi, T. militinae), а также гексаплоидных (T. aestivum, T. compactum) видов [3].
У мягкой пшеницы доминантный ген Hl1, определяющий опушение листа ряда сортов СССР, был впервые выявлен в хромосоме 4B [4]. Позже он был картирован с помощью микроса-теллитных маркеров в длинном плече этой хромосомы [5]. Второй доминантный ген Hl2 был обнаружен у опушенного китайского сорта Hong-mang-mai [6]. При помощи моносомного и тело-сомного анализа он был локализован в хромосоме 7B в коротком плече на расстоянии 14.3% от центромеры.
В коллекции интрогрессивных линий мягкой пшеницы "Арсенал", которые несут фрагменты генетического материала от Ae. speltoides Tausch. на генетическом фоне неопушенного сорта Родина [7], была обнаружена одна линия, 102/00i, формировавшая опушение на листьях, привнесенное от донорского генотипа. Методами генетического анализа было показано, что оно контролируется одним геном, а моносомным анализом этот ген был локализован в хромосоме 7В [8]. В дальнейшем ген был картирован с помощью микросател-литных маркеров, как и Hl2, в коротком плече этой хромосомы и назван Hl2aesp [5]. В последней работе также был отмечен аллелизм гена Hl2aesp линии 102/00i гену Hl2 сорта Hong-mang-mai.
Учитывая большое фенотипическое разнообразие по опушению листа у мягкой пшеницы и ее сородичей [1, 3], можно предполагать, что существует гораздо больше генов, определяющих этот признак, чем известно сегодня. Однако их выявлению препятствуют затруднения фенотипиче-ского анализа этого признака. Типичными методами определения морфологии трихом на листьях пшеницы в генетическом анализе являлась визуальная и тактильная оценка или визуальный подсчет при помощи оптико-увеличительных приборов [4, 5, 8], а также сканирующая электронная микроскопия [6]. К недостаткам одних методов можно отнести низкую точность оценок, других — трудоемкость методов подсчета, что осложняет их применение для анализа большого количества
растений. Перспективными в этой связи являются компьютерные методы, основанные на анализе цифровых изображений. Так, в работе Бенша с соавт. [9] представлен алгоритм подсчета трихом на листовых пластинах А. thaliana, который позволяет анализировать расположение трихом по изображению на фотографии. Одновременно был разработан метод, позволяющий по микрофотографии сгиба листа пшеницы посредством компьютерной обработки изображений получать информацию о структуре опушения листа в цифровом виде [10, 11]. Первые результаты его использования показывают большую вариацию количественных характеристик опушения листа у сортов мягкой пшеницы, что говорит в пользу его полигенного контроля [10, 12].
Одновременно с усовершенствованием методической стороны анализа опушения необходимо расширять его генетическую базу, привлекая для исследований доноров различных типов опушения. В настоящей работе был проведен генетический и моносомный анализ опушения изогенных линий АНК 7А, АНК 7В и АНК 7С, созданных на основе сорта Новосибирская 67 [13], которые имеют хорошо выраженное и отличное от родительского сорта опушение листа. Цель работы — установить генетическое родство этого опушения с уже известными на сегодня генами. Для этого был использован метод высокопроизводительного фенотипирования [11], позволяющий выделять фенотипические классы потомков в скрещиваниях на основе количественных характеристик опушения листа. Полученные данные позволили сформулировать гипотезу о наличии гомеоал-лельной серии генов, контролирующих опушение листа, в хромосомах седьмой гомеологиче-ской группы мягкой пшеницы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Генетический материал. Объектом исследований были яровые изогенные линии АНК 7А, АНК 7В и АНК 7С, полученные С.Ф. Ковалем на основе сорта Новосибирская 67 [13]. Они несут нетипичное для родительского сорта Новосибирская 67 опушение листа. Согласно данным тактильного и визуального анализа сорт-реципиент Новосибирская 67 имеет мягкое на ощупь, равномерное опушение, а рассматриваемые линии несут на поверхности листа длинные упругие трихомы. Донорами этого признака для линий АНК 7А и АНК 7В были сорта, полученные в Китае (к-26011 и к-46444 из коллекции ВИР, Санкт-Петербург), а для АНК 7С — сорт Лютесценс 234 (СССР, Бурятия) [13].
Для генетического анализа данного признака в качестве носителя рецессивного фенотипа — отсутствие опушения листа — был использован сорт Родина. Три линии были скрещены с носителем
рецессивного фенотипа, и получены три популяции F2. Расщепление на фенотипические классы по опушению листа изучали визуально среди этих растений F2, выращенных в двух повторностях — в полевых условиях и в гидропонной теплице. Всего изучалось 170—180 растений в каждой комбинации скрещиваний.
Для моносомного анализа опушения листа были использованы моносомные линии сорта Диамант 2 по хромосомам 7А, 7В или 7Э. Для получения гибридов F1 с помощью цитологического анализа клеток пыльников, окрашенных ацето-кармином, отбирали растения, несущие в М1 мейоза унивалент (20" + 1'). Они использовались в качестве материнских при скрещивании с изо-генными линиями АНК 7А, АНК 7В и АНК 7С. Таким же способом среди гибридов первого поколения отбирали моносомные растения, которые самоопыляли. Потомства этих растений образовывали моносомные популяции F2 по хромосомам 7А, 7В и 7Э для всех трех изогенных линий.
Моносомные популяции F2 выращивались в условиях теплицы, по 50—60 растений каждой популяции в каждом из двух различных вегетационных сезонов. Всего было изучено более 350 растений.
Условия выращивания. Получение гибридного материала и наблюдения проводили в условиях гидропонной теплицы ЦКП Искусственного выращивания растений Института цитологии и генетики СО РАН. Во время выращивания поддерживались температура, водный режим и режим освещения, необходимые для выращивания яровой пшеницы. В качестве субстрата был использован керамзит, в качестве питательного раствора — раствор Кнопа [14]. Полевые опыты проводили при яровом посеве в 2009 г. в Новосибирске в условиях ЦКП Селекционно-генетическая лаборатория ИЦиГ СО РАН. Подготовку почвы, внесение минеральных удобрений и уход за растениями проводили по принятой для данных условий возделывания агротехнологической схеме.
Анализ изображений сгиба листа. Для определения количественных характеристик опушения были использованы изображения сгиба листа. Протокол получения стандартных изображений включает в себя сбор листьев, приготовление препаратов и получение контрастных изображений при помощи светового микроскопа [10].
Изображения для получения цифровых характеристик опушения листа анализировали при помощи разработанного в лаборатории эволюционной биоинформатики и теоретической генетики ИЦиГ СО РАН программы ЬНОйе^ 2 [11]. Эта программа, получая на вход стандартное микроизображение сгиба листа, автоматически определяет количественные характеристики опушения. Изображения имеют один масштаб, поэтому дан-
Рис. 1. Типичные изображения сгиба листа, используемые для извлечения количественных характеристик опушения листа. а — сорт Новосибирская 67. б — АНК 7А.
ные, полученные с ряда изображений, пригодны к сравнению.
Программа ЬНЭе1ее1 2 измеряет длину индивидуальных трихом на изображении и выводит данные в виде вектора частот п распределения трихом по длинам. Каждый элемент такого вектора пх отражает число трихом, принадлежащих определенному дискретному интервалу длин ^^ — 1); d(i)]. Размер интервала длин d задается пользователем. В настоящей работе использовали интервал 10.5 мкм, что при наших масштабах изображения эквивалентно 5 пикселям. Например, при заданном выше интервале длин первые три элемента вектора равны: п1 = 3, п2 = 5 и п3 = 2. Это означает, что на изображении программой идентифицированы 3 трихомы с длиной в интервале [0; 10.5], 5 трихом с длиной в интервале (10.5; 21] и 2 трихомы с длиной в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.