УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2004, том 124, № 3, с. 211-215
УДК 575:595.763.79
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ МУТАГЕНЕЗА У ДРОЖЖЕЙ-САХАРОМИЦЕТОВ *
© 2004 г. И. В. Федорова, С. В. Ковальцова
Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина
Обобщены данные многолетних исследований спонтанного и индуцированного мутагенеза у дрожжей ЗассЬагошусез сегеу181ае, включая взаимосвязь с процессами репарации и генетический контроль.
В исследованиях генетического контроля мутационного процесса у дрожжей, выполненных в лаборатории генетики эукариот ПИЯФ РАН, руководителем которой в течение почти 25 лет являлся И.А. Захаров, можно выделить два четко разделенных во времени этапа: на первом, более раннем этапе изучалась взаимосвязь процессов репарации и спонтанного и индуцированного мутагенеза; на втором - генетический контроль спонтанного и индуцированного мутагенеза.
Впервые данные о том, что мутации возникают в результате ошибок, происходящих в процессе репарации поврежденной ДНК, были получены в работах с радиочувствительными мутантами, т.е. с мутантами с нарушенной системой репарации, у E. coli [24].
Тогда же, практически одновременно с зарубежными исследователями в нашей лаборатории [2, 3, 14] были выделены радиочувствительные мутанты rad2 , rad16, rad50, rad54, uvs112, xrs2, xrs4, причем три последних оказались уникальными.
В мировой литературе описано несколько десятков мутаций радиочувствительности у дрожжей, распределенных по трем путям репарации летальных повреждений ДНК.
Влияние мутаций радиочувствительности на спонтанный и индуцированный мутагенез исследовали на полученных в нашей лаборатории мутантах по эксцизионному (rad2, radl6 и uvs112) и рекомбинационному пострепликативному пути (rad50, rad54 , xrs2 и xrs4).
В нашей лаборатории впервые в мире был обнаружен мутаторный эффект мутаций rad2 и rad16, повышающих в 7-10 раз частоту реверсий к аденин-независимости у мутантов ade2 [10]. Сильный мутаторный эффект выявлен у мутации rad54, увеличивающей частоту реверсий по потребности в урациле и прямых мутаций по потребности в аденине в 7-10 раз [12]. На основании этих данных был сделан вывод о том, что система,
* Авторы статей этого номера журнала посвящают свои публикации 70-летию чл.-корр. РАН И.А. Захарова.
обеспечивающая естественную радиоустойчивость клетки, эволюционно сложилась прежде всего как механизм поддержания стабильности генетического материала, а мутации, нарушающие отдельные звенья этой системы, могут существенно повышать частоту спонтанных мутаций вследствие отсутствия репарации естественно возникающих повреждений ДНК.
Инактивация генов, отвечающих за радиочувствительность, изменяет частоту возникновения мутаций, индуцированных различными мутагенными факторами. Так, мутация по эксцизионному пути репарации rad2 повышает частоту УФ-индуцированных мутаций устойчивости к аминокислоте серину и мутаций дыхательной недостаточности по сравнению со штаммом дикого типа при равных дозах облучения [7, 17, 25]. В то же время мутации хг82 и х^4, относящиеся к рекомбинационному пути репарации, понижают частоту УФ-индуцированных мутаций устойчивости к серину и реверсий по нонсенс-мутации ade2-226 [7]. Мутация х^4 повышает частоту цитоплазма-тических мутаций, что позволяет предположить, что репарационная система у дрожжей действует не только в ядре, но и в цитоплазме клетки.
При изучении индукции различными мутагенами мутаций в локусе АОЕ2 у радиочувствительных мутантов было обнаружено влияние мутаций радиочувствительности не только на их количественный выход, но и на природу индуцируемых мутаций. Анализ комплементации мутаций в локусе АОЕ2, индуцированных УФ-лучами у мутантов rad2 и rad54, не выявил достоверного отличия от штамма дикого типа, но хгз4 и особенно хг82 достоверно увеличивали частоту появления не-комплементирующих (НК) мутаций, т.е. они влияли на природу УФ-индуцированных мутаций [7].
Те же мутанты, за исключением хгз4, использовались в работе по изучению мутагенного действия бифункционального акридин-иприта, аналога 1СЯ170 [15]. Было показано, что мутация rad2 резко увеличивает чувствительность к летальному и мутагенному действию акридин-ипри-
та (АИ). АИ известен как специфический интер-каляторный мутаген. Вероятно, в результате блокирования мутацией тай2 одного из первых этапов эксцизионного пути репарации у мутанта тай2 теряется способность к удалению включившихся в ДНК молекул АИ, что служит причиной возникновения мутаций в процессе репликации, а также гибели клеток. Мутанты тай54 и хт82 не отличаются от штамма дикого типа по частоте возникновения мутаций аденин-зависимости, т.е. мутации, относящиеся к рекомбинационному пути репарации, не принимают участия в реализации мутаций, индуцируемых этим мутагеном. Что касается природы мутаций, вызываемых АИ, оказалось, что мутации радиочувствительности не влияют на их спектр, поскольку почти все изученные мутанты несут НК-мутации. Ни в одном случае не наблюдалось возникновения мутантов с неполным проявлением. Во многих зарубежных работах показано, что АИ отличаются высокой мутагенной специфичностью и индуцируют в основном мутации типа сдвига рамки считывания. Следовательно, именно эти мутации относятся к классу НК. Большинство АИ-индуцированных мутантов ревертировало только под действием мутагенов, индуцирующих мутации типа сдвиг рамки считывания, и не ревертировало под действием мутагенов, вызывающих мутации типа замен пар оснований, таких как, например, 6-гидро-ксиламинопурин (6-ГАП).
Молекулярную природу мутаций в гене ЛОЕ2 исследовали с помощью методов межаллельной комплементации (МАК) и межаллельной комплементации, индуцированной супрессией (МАКИС), а также высокоспецифичных мутагенов, индуцирующих мутации определенного типа [1, 11]. Следует отметить, что изложенная выше схема была предложена в то время, когда более точные моле-кулярно-биологические методы определения природы мутаций только еще разрабатывались и были мало доступны для широкого использования. На основании этой схемы удалось оценить спектр мутаций в гене АЭЕ2, индуцированных различными мутагенами. Впоследствии эта же схема была использована для определения молекулярной природы прямых генных мутаций у мутанта гаё2, индуцированных УФ-лучами и АИ в гене ЛОЕ2 [21]. Было показано, что у штамма дикого типа У Ф-лучи индуцируют 45% транзиций ГЦ —► АТ, а у тай2 77%, АИ вызывал 60% мутаций типа сдвиг рамки считывания у штамма дикого типа и 84% у тай2. На основании этого был сделан вывод, что мутация тай2 влияет на специфичность УФ- и АИ-индуцированного мутагенеза. Эти данные хорошо согласуются с точкой зрения, что большинство мутаций у штаммов с нормальной системой репарации индуцируются дорепли-кативным механизмом, а у тай2 - постреплика-тивным. Результаты данной работы также позво-
ляют предположить, что цитозин-содержащие фотопродукты отвечают за большинство предму-тационных повреждений ДНК и доля этих мутаций может возрастать в процессе эксцизионной репарации УФ-индуцированных фотопродуктов.
В конце этого раздела приведем краткие сведения о влияющих на спонтанный и индуцированный мутагенез мутациях радиочувствительности, полученных в нашей лаборатории.
Известно, что мутация rad2 относится к эпи-статической группе RAD3 мутаций, нарушающих эксцизионную репарацию. Продуктом гена RAD2 является структуро-зависимая эндонуклеаза. Выявлено влияние этой мутации на частоту как спонтанных, так и индуцированных различными мутагенами мутаций, а также на их природу. Показано, что мутация rad16 - достаточно сильный спонтанный мутатор. Мутация rad54 относится к эпистатической группе RAD52 мутаций, блокирующих рекомбинационную репарацию. В работах [12, 13] показано, что мутация является сильным спонтанным мутатором и блокирует репарацию двойных разрывов ДНК. Уникальные мутации xrs2 и xrs4 также относятся к рекомбинационному пути репарации. Эти мутации были картированы: xrs2 - на правом плече хромосомы IV [9], а xrs4 -на правом плече хромосомы XIII [23]. Они изменяли частоту индуцированного мутагенеза, а главное - влияли на природу индуцируемых мутаций [7].
Рассмотрим работы, выполненные в последние годы и посвященные выделению и изучению свойств мутантов дрожжей, обладающих повышенной частотой спонтанного мутагенеза.
Установлено, что спонтанная изменчивость организма генетически детерминирована. Данные о тесной связи между спонтанным мутационным процессом и репарацией ДНК приведены в предыдущем разделе.
Первые работы по получению мутантов, характеризующихся повышенной частотой спонтанного мутагенеза, были проведены в нашей лаборатории в конце 80-х годов [5, 21, 22]. Был описан ряд мутантов, характеризующихся повышенной частотой спонтанного и индуцированного азотистой кислотой мутагенеза. Генетический анализ позволил идентифицировать 4 неаллельных мутации: himl, him2, him3 и himX (от high induced mutagenesis). Абсолютная частота индукции аденин-зависимых мутантов у этих штаммов возрастала после УФ-облучения и особенно (до 0.1%) после воздействия 6-ГАП. Изучение влияния мутаций him на частоту внутригенной митотической рекомбинации позволило разделить все мутанты him на 2 группы: himl резко повышала ее, а him2, him3 и himX влияли слабо.
В это же время продолжалась работа по поиску новых мутантов с повышенной спонтанной му-
табильностью [6, 16]. Была отобрана коллекция из 16 штаммов, характеризующихся повышенной частотой возникновения прямых мутаций канава-нин-устойчивости. Генетический анализ показал, что мутаторный фенотип каждого мутанта обусловлен одиночной ядерной мутацией. Рекомбина-ционный тест позволил идентифицировать 5 не-аллельных мутаций hsm (от high spontaneous mutagenesis). Все мутанты him и hsm оказались устойчивы к летальному действию различных мутагенов: УФ-света, у-лучей, этилметансульфона-та, азотистой кислоты, 6-ГАП и нитрозометил-мочевины, что свидетельствовало о нормальной работе систем репарации летальных повреждений у этих мутантов. Изучение спонтанного мутирования к канаванин-устойчивости показало, что у всех мутантов him и hsm его частота была по
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.