БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 1, с. 41 - 48
УДК 577.213.4
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ОКИСЛЕННОГО ^-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА БЕЛКА XRCC1: КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ in silico
© 2014 г. Дж. Мехрзад1*, М. Монаджеми2, М. Хашеми3
1 Department of Biochemistry, Neyshabur Branch, Islamic Azad University, Neyshabur, Iran; fax: + (98)5516621931, E-mail: mehrzadjam@yahoo.com 2 Department of Chemistry, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran; E-mail: m_monajjemi@yahoo.com 3 Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, Zahedan, Iran; E-mail: mhd.hashemi@gmail.com
Поступила в редакцию 07.03.13 После доработки 08.07.13
Вырезание поврежденных азотистых оснований — это главный репарационный путь (BER-репарация), призванный удалять эндогенные и экзогенные мутационные повреждения ДНК. Белок XRCC1 (Х-рей кросс-комплементарная группа 1) принимает участие в BER-репарации в качестве поддерживающего каркасного белка. Окисленный N-концевой домен (NTD) этого белка способен формировать дополнительные связи с ДНК-полимеразой ß (Pol ß). Изменения каких-либо аминокислотных остатков в белке (например, приводящие к образованию форм XRCC1, XRCC4 и других) могут изменять его стабильность и функционирование. Многие кодирующие районы генов имеют единичные нуклеотидные замены, обусловливающие генетический полиморфизм, что может приводить к конформационным изменениям кодируемых белков и вызывать какие-либо заболевания. Аминокислотные замены R7^L и R107^H (им соответствуют мутант-ные формы R7L и R107H) локализуются в N-концевом домене белка XRCC1 (XRCC1-NTD). В представленной работе были исследованы методами in silico путем компьютерного моделирования молекулярно-меха-нические и физико-химические свойства нескольких окисленных XRCC1-NTD («дикого» типа и мутант-ных форм R7L, R107H и R7L&R107H) в водных растворах и при различной температуре (290, 295, 298, 301, 304, 309, 310, 311 и 312 K). Сравнение рассчитанных средних значений потенциальной энергии окисленных XRCC1-NTD показало, что замена R7^L стабилизирует белок, а замены R107^H и R7^L & R107^H делают его нестабильным и приводят к мутантным формам с нарушенными функциями. Количественная оценка взаимоотношений структуры и функции окисленного XRCC1-NTD и результаты моделирования стыковки NTD с Pol ß показали, что мутация R7^L благоприятно, а мутации R107^H и R7^L&R107^H — неблагоприятно сказывались на функциях XRCC1-NTD. В последних двух случаях N-концевой домен уже не мог взаимодействовать с Pol ß, так же как NTD «дикого» типа, и, следовательно, способность белка XRCC1 участвовать в репарации ДНК нарушалась. Расчеты по уравнению dE = 3E/(3X)v dT + 3E/(3V)X dV позволили установить, что оптимальная температура для функционирования XRCC1-NTD соответствует температуре тела 310 К.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: XRCC1, NTD, dE, полиморфизм, in silico, стыковка.
Наиболее распространенными видами повреждений ДНК, тысячами происходящими в клетках ежедневно в нормальных физиологических условиях в отсутствие внешних воздействий, являются: модификация оснований, возникновение абазических участков (АР-сайтов) и одноцепочечных разрывов [1, 2]. В отсутствие репарации такие нарушения представляют опасность для генетической стабильности и жизнеспособности клеток и приводят к ускорению мутагенеза и хромосомным аберрациям [3—8]. Вы-
* Адресат для корреспонденции.
резание поврежденных азотистых оснований (БЕЯ-репарация) является главным путем, предназначенным для исправления эндогенных и индуцированных мутагенами нарушений ДНК. Этот репарационный процесс включает несколько последовательных реакций. Сначала специфическая ДНК-гликозилаза, узнающая поврежденные основания, расщепляет М-гли-козидную связь, соединяющую эти азотистые основания с фосфосахаридным каркасом. Возникающий АР-сайт (апуриновый/апиримидино-вый участок) узнается АР-эндонуклеазой 1 (АРЕ1), которая надрезает 5'-фосфодиэфирную связь,
следующую за АР-сайтом. Далее ДНК-полиме-раза ß (Pol ß) добавляет один нуклеотид с 3'-OH конца надрезанного АР-сайта и отсекает фос-фосахаридный остаток, лишенный азотистого основания. И, наконец, ДНК-лигаза завершает репарацию, сшивая концы надрезанной цепочки ДНК [9].
Х-рей кросс-комплементарная группа 1 (XRCC1) — белок, участвующий в репарации од-ноцепочечного разрыва в ДНК, обнаружен у эу-кариот, начиная от насекомых и вплоть до человека. Он составлен несколькими доменами: Л-кон-цевой (NTD), центральный, домены BRCT-I и BRCT-II (С-терминальный участок белка 1, чувствительного к раку молочной железы) [10—13]. Сам белок XRCC1 не обладает ферментативной активностью, но выполняет многообразные функции при BER-репарации ДНК, а именно осуществляет объединение Pol ß, поли (ADP-рибоза)-полимеразы (PARP) и ДНК-лигазы III в единый репаративный комплекс [14]. Считается, что, связывая Pol ß и поврежденную ДНК, белок XRCC1 может поддерживать матричную цепь в месте повреждения так, что репарация короткого надреза может осуществляться достаточно эффективно [15].
Методом рентгеноструктурного анализа были обнаружены две кристаллические формы комплекса XRCC1-NTD/Pol ß. Установлено, что окисленный и восстановленный XRCC1-NTD имеют различные конформации, характеризующиеся различными дисульфидными связями, существенными различиями во вторичной структуре, в топологии свернутого белка и в поверхностном электростатическом заряде. Несмотря на то, что все эти изменения локализуются вдали от участка взаимодействия XRCC1 с Pol ß, окисленный Л-концевой домен формирует дополнительные связи с полимеразой, способствующие увеличению сродства между двумя белками примерно на порядок [16, 17]. Ранее было обнаружено, что «нокаут» по белку XRCC1 у мышей приводил к ранней гибели эмбрионов [18]. Клетки животных отряда грызунов, не способные синтезировать XRCC1, проявляли повышенную чувствительность к различным токсинам, воздействующим на ДНК [19—22]. Лишение клетки белка XRCC1 приводило к дестабилизации ее генома, в частности, к увеличению частоты спонтанных или индуцированных хромосомных транслокаций и делеций [21—23].
Стабильность белка может быть нарушена путем единичных аминокислотных замен, приводящих к одному или к нескольким из следующих изменений в его молекулах: к переориентации водородных связей, солевых мостиков и гидрофобных взаимодействий, нарушению ди-
сульфидных связей, к пространственному перемещению объемных боковых ароматических радикалов [24]. Кодирующий район гена ХЯСС1 включает в себя несколько неконсервативных участков, обозначенных как R399Q, R194W, R280H, R7L и R107H по аналогии с сопутствующими аминокислотными заменами в кодируемом белке ^399^, R194^W, R280^H, R7^L&R107^H соответственно) [25]. Единичные нуклеотидные замены в этих участках приводят к изменению конформационной стабильности белка XRCC1 и его связывающей и регу-ляторной активностей, что, в конечном счете, выражается в нарушении/изменении его способности репарировать ДНК [26]. Лишь замены R7^L и R107^H локализуются в XRCC1-NTD (остатки 1—161), а для других точечных замен, к сожалению, нет данных в PBD (белковый банк данных). Вышеуказанные замены в XRCC1-NTD были способны изменять его биологическую активность. Поэтому мы изучили ¡и яШео путем компьютерного моделирования стабильность и некоторые физико-химические свойства XRCC1-NTD «дикого» типа (и Ащ107) и мутантных полиморфных типов ^еи7 и №8107 по отдельности или вместе). До сих пор было проведено лишь несколько исследований для выяснения связи между вышеуказанными мутант-ными формами XRCC1 и некоторыми видами рака. Авторы этих работ отметили, что эта прямая или косвенная взаимосвязь обусловлена конформационными изменениями белка [27—34], но дальше этого исследования не продвинулись. Поэтому в первую очередь мы в своей работе изучили именно конформационные изменения XRCC1-NTD разных полиморфных типов путем компьютерного моделирования ¡и яШео. Полученные результаты могут помочь предсказать, какие точечные аминокислотные замены положительно, а какие — отрицательно сказываются на состоянии человеческого организма. Мы также выяснили, как изменения температуры могут сказываться на структуре белка XRCC1 и его стабильности.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Данные рентгеноструктурного анализа окисленного XRCC1-NTD «дикого» типа были получены из PBD (код для ^-концевого домена XRCC1 — 3K77). Молекулярное моделирование и вычисления выполняли с помощью программы Hyper Chem 8.1.81 [35]. В соответствии с этой программой для расчета потенциальной энергии различных мутантных форм окисленного XRCC1-NTD (R7L, R107H и R7L&R107H) при
разной температуре (290, 295, 298, 301, 304, 309, 310, 311 и 312 K) в водном растворе был использован молекулярно-механический метод (MM), моделирование по методу Монте-Карло и метод силового поля amber 99. Мутантные формы R7L и R107H N-концевого домена белка XRCC1 были смоделированы с помощью Swiss-PDB Viewer _4.04_PC. Оптимизация геометрии молекул «дикого» и мутантных окисленных NTD была проведена до расчета положений отдельных аминокислотных остатков и моделирования по методу Монте-Карло. После выполнения анализа по методу Монте-Карло при различной температуре в водном растворе мы вычислили также объемы и площади поверхности окисленных NTD. Кроме того, моделирование стыковки N-концевых доменов с каталитическим доменом ДНК-полимеразы ß (pol ß CD) было выполнено с помощью программы AutoDock vina [36].
Выражение dE = öE/(öX)v dT + ÖE/(ÖV)X dV для окисленного XRCC1-NTD «дикого» типа было вычислено путем расчета частных производных потенциальной энергии (Е): дЕ/дТ и дЕ/öV, где V — объем и X — температура системы. дЕ = Emax - En и TEmax - Tn. E = f(T,V) и V = f(T), поэтому: дЕ/öV = дЕ/дТ x ÖX/ÖV = (дЕ/дТ)/ /(ÖV/ÖX).
дЕ/дТ и öV/öX при различной температуре можно рассчитать из зависимостей, приведенных на рис. 1 и 2. Пары образцов сравнивали в t-тесте Стьюдента с помощью программы SPSS v20.0.
рушается нативная конформация белка, и он может денатурировать. Также тепловая денатурация связана с повреждением двумерной водной обол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.