ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 9, с. 1009-1017
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 575.174.015.3:633.112.1
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ОБРАЗЦОВ ТВЕРДОЙ ПШЕНИЦЫ
(Triticum durum Desf.) АЗЕРБАЙДЖАНА
© 2015 г. Э. С. Гаджиев, З. И. Акпаров, Р. Т. Алиев, С. В. Сеидова, В. И. Иззатуллаева, С. М. Бабаева, М. А. Аббасов
Институт генетических ресурсов Национальной академии наук Азербайджана, Баку AZ1106, Азербайджан
e-mail: elcin_haciyev_1985@mail.ru Поступила в редакцию 07.11.2014 г.
Приведены результаты оценки генетического разнообразия 110 генотипов твердой пшеницы Азербайджана c помощью ISSR-маркеров. В целом было идентифицировано 107 ПЦР-фрагментов. Количество амплифицированных фрагментов варьировало от 9 до 18 локусов. Использованные ISSR-праймеры выявили высокий уровень полиморфизма (в среднем 82%). Анализ полиморфизма фрагментов ДНК при использовании ISSR-праймеров оказался достаточно информативным методом, который позволил различить образцы твердой пшеницы. На основе полученных данных была построена дендрограмма, позволяющая сгруппировать генотипы в 11 основных кластеров. Обнаружено отсутствие конкретной связи генетической структуры генотипов с их географическим распространением. Однако некоторые образцы были выявлены как уникальные и локализовались в отдельных кластерах. Высокий показатель в результате оценки генетического разнообразия по каждому ISSR-локусу был обнаружен как среди изученной коллекции, так и между разновидностями твердой пшеницы.
DOI: 10.7868/S0016675815090040
Одним из приоритетных направлений сельского хозяйства Азербайджана является выращивание зерновых культур, среди которых пшеница играет ведущую роль. Исключительное разнообразие почвенно-климатических условий способствовало развитию здесь богатого растительного покрова, что позволило включить Азербайджан в один из наиболее вероятных центров происхождения пшеницы [1]. Народная селекция пшеницы в Азербайджане ведется с древнейших времен. Сорта твердой пшеницы — Сары бугда, Гара бугда, Аг бугда и Гырмызы бугда возделывались на протяжении столетий. Работы по сбору распространенных в Азербайджане видов, разновидностей и популяций пшеницы проводятся с большим успехом. В настоящий момент в Национальном генбанке хранится более 2000 коллекционных образцов пшеницы [2, 3]. Азербайджан по количеству разновидностей зерновых культур представляет особый интерес для изучения полиморфизма ДНК генома твердой пшеницы, произрастающих в различных регионах страны.
Твердая пшеница (Triticum durum Desf.) характеризуется большим полиморфизмом, и по количеству разновидностей, экологических типов и сортов уступает лишь мягкой пшенице [4]. В настоящее время созданы новые сорта, в которых сосредоточено огромное генетическое разнообразие, накопленное за тысячелетия отбора. Для того чтобы осуществить рациональное сохранение и эффективное использование генетического
разнообразия, необходимы определенные знания о географическом распределении сортов. В первую очередь необходимо уделить особое внимание сохранению уникальных генотипов, а для этого иметь представления о том, в каких регионах можно найти редкие, выделяющиеся из мирового генофонда сорта твердых пшениц. Твердая пшеница с точки зрения генетики остается относительно малоизученным видом, поскольку большинство исследователей, работающих на злаках, занимаются мягкой пшеницей. Только в последнее время появились работы, касающиеся вопросов генетического маркирования сортов твердой пшеницы на основе ПЦР-анализа, вопросов ее происхождения и биоразнообразия [5, 6].
Использование генетических маркеров может способствовать решению многих задач в селекционной практике Азербайджана. Как известно, селекция твердой пшеницы весьма трудоемка, поскольку реализация генетического потенциала растения очень сильно зависит от условий его выращивания [7]. Использование при селекционной работе с твердой пшеницей новейших достижений современной генетики, в частности, методов генетического маркирования, позволит эффективнее проводить отбор, создавать новые и улучшать при этом старые сорта. Кроме того, может оказать помощь в решении ряда основных задач: в изучении генетического разнообразия современных сортов, идентификации и картировании генов хозяйственно ценных признаков и
выявлении их носителей как ценного исходного материала для гибридизации, упрощении нахождения и устранения дупликатов в коллекциях гер-моплазмы, паспортизации и классификации сортов растений, генетического мониторинга в селекции и генетике сельскохозяйственных растений.
Наиболее перспективным подходом для анализа генетического разнообразия представляется использование методов молекулярной генетики, основанных на анализе полиморфизма ДНК (RAPD, AFLP, ISSR, SSR, SNP и т.п.), позволяющих получить индивидуальную характеристику отдельного генотипа — ДНК-профиль [8—10]. Для исследований межсортового полиморфизма, выявления генетического сходства генотипов разных сортов пшеницы нами был выбран ISSR-ме-тод (InterSimpleSequenceRepeat). В настоящее время ISSR-метод широко используется при выявлении внутривидового полиморфизма, в первую очередь у близкородственных генотипов культивируемых растений [11, 12]. ISSR-маркеры полиморфны и могут быть применены в исследованиях генетического разнообразия, филогении, молекулярном маркировании геномов хлебных злаков [13]. ISSR-праймеры могут быть ди-, три-, тетра- или пентануклеотидными мотивами микросателлитов, давая огромное количество возможных продуктов амплификации [14, 15].
Цель настоящей работы — оценить генетическое разнообразие 110 генотипов твердой пшеницы Азербайджана с использованием метода молекулярного анализа, определить особенности географического распределения генотипов и характер их генетической дифференциации. Выявление степени генетического сходства и различия между генотипами позволит более обоснованно подбирать родительские пары для скрещивания, что в итоге реализуется в создании сортов и гибридов, обладающих комплексом ценных признаков, ускоренными темпами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Материалом для мо-лекулярно-генетических исследований послужили 100 образцов Генбанка ИГР НАНА и 10 местных сортов твердой пшеницы (Шерг, Тертер, Ву-гар, Аг бугда, Берекетли 95, Мирбешир 50, Гарагылчыг 2, Муган, Шираслан, Ширван) из различных регионов Азербайджана. По количеству в основном преобладают следующие образцы: var. apulicum (12), var. leucomelan (15), var. hor-deiforme (19) и 27 генотипов var. leucurum (табл. 1).
Молекулярный анализ. Экстракция ДНК была проведена согласно ЦТАБ (цетилтриметиламмо-ниум бромид) протоколу, предложенному Doyle et Doyle [16] с некоторыми модификациями. Концентрацию и степень чистоты молекулы ДНК определяли с помощью нанометра (Thermo,
NANO DROP, 2000). Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл, содержащей 2 мкл 10х ПЦР-буфера, 2 мкл смеси dNTP (5 мМ), 1.5 мкл MgCl2 (50 мМ), 2 мкл каждого праймера (15 пмоль/мкл), 0.1 мкл фермента Taq-полимеразы (1 U/мкл) и 2 мкл выделенной ДНК (50 нг/мкл). В результате проведенной оптимизации были выбраны следующие условия амплификации: предварительная денатурация при температуре 94°C в течение 5 мин, последующие 35 циклов — денатурация 94°С (1 мин), температура отжига в зависимости от использованного праймера (45 с), синтез — 5 мин при 72°C, финальный цикл элонгации при температуре 72°C в течение 10 мин. Амплификацию проводили в программируемом термоциклере T100 (Applied Biosystems, USA). Для мультилокусного ме-жмикросателлитного анализа были апробированы 8 полиморфных ISSR-праймеров длиной 15— 18 нуклеотидов. Электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 2%-ном агарозном геле с добавлением этидиум бромида и визуализировали под ультрафиолетовым светом с использованием гель-документирующей системы BioRad.
Статистическая обработка полученных данных. Анализ амплифицированных фрагментов был проведен с помощью компьютерной программы PAST [17]. Для выявления уровня полиморфизма маркеров между изученными генотипами данные были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков, в которых "наличие" или "отсутствие" ПЦР-фрагментов одинаковых по размеру ампликонов соответствовало значениям 1 и 0.
В качестве показателей генетического разнообразия определялись число и доля полиморфных локусов и индекс генетического разнообразия. Коэффициент генетического разнообразия вычислялся согласно формуле Вейра [18]:
n
H = 1 - X P2,
i
где H — индекс генетического разнообразия, p¡ — частота встречаемости аллелей. Построение дендрограммы и оценка генетической близости между образцами проводились на основе индекса генетического сходства Жаккарда, кластеризация осуществлялась с помощью программы PAST.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ полиморфизма 110 генотипов твердой пшеницы проводили с использованием 8 из 20 протестированных нами праймеров, с которыми проходила стабильная амплификация и получались наиболее воспроизводимые результаты. Основная зона распределения фрагментов располагалась в диапазоне 100—2000 пн. Было выявлено
Таблица 1. Список образцов, использованных в работе, и их географическое распространение
Номер генбанка Образец Географическое происхождение Номер генбанка Образец Географическое происхождение
6152 уаг. арыНсыт Нахичевань 6144 уаг. ¡еысотеШп Лерик
6101 уаг. 1еысыгыт Товуз 6138 уаг. ¡еысотеШп Евлах
6304 уаг. 1еысыгыт Апшерон 6130 уаг. тыгЫете Саатлы
6109 уаг. коМе1/огте Агдам 6309 уаг. ¡еысотеШп Апшерон
6123 уаг. те1апоры$ Товуз 6135 уаг. ¡еысотеШп Агджабади
6086 уаг. 1еысыгыт Казах 6121 уаг. Ьоеы/И Шамахы
6157 уаг. арыНсыт Нахичевань 6160 уаг. ге1скепЬаскп Закатала
6136 уаг. 1еысоте1ап Девичи 6310 уаг. ¡еысотеШп Апшерон
6148 уаг. арыНсыт Исмаиллы 6156 уаг. арыНсыт Нахичевань
6087 уаг. 1еысыгыт Агдара 6314 уаг. ¡еысыгыт Апшерон
6133 уаг. а1Ьогоутаа1е Джалилабад 6119 уаг. коМе1/огте Нахичевань
6154 уаг. арыНсыт Нахичевань 6128 уаг. теШпоры5 Казах
6158 уаг. оЫсыгыт Закатала 6124 уаг. теШпоры5 Геранбой
6089 уаг. 1еысыгыт Евлах 6098 уаг. ¡еысыгыт Агдаш
6231 уаг. 1еысыгыт Джалилабад 6318 уаг. ¡еысыгыт Апшерон
6114 уа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.