научная статья по теме ГЕНЕТИЧЕСКОЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРЕХ КЛОНОВ PORPHYRIDIUM PURPUREUM (BORY DE SAINT-VINCENT, 1797) DREW ET ROSS, 1965 (RHODOPHYTA) ИЗ КОЛЛЕКЦИИ МОРСКИХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ИНСТИТУТА БИОЛОГИИ МОРЯ ИМ. А.В. ЖИРМУНСКОГО ДВО РАН Биология

Текст научной статьи на тему «ГЕНЕТИЧЕСКОЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРЕХ КЛОНОВ PORPHYRIDIUM PURPUREUM (BORY DE SAINT-VINCENT, 1797) DREW ET ROSS, 1965 (RHODOPHYTA) ИЗ КОЛЛЕКЦИИ МОРСКИХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ИНСТИТУТА БИОЛОГИИ МОРЯ ИМ. А.В. ЖИРМУНСКОГО ДВО РАН»

БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2014, том 40, № 5, с. 373-383

УДК 582.261+577.95 АЛЬГОЛОГИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ТРЕХ КЛОНОВ PORPHYRIDIUM PURPUREUM (BORY DE SAINT-VINCENT, 1797) DREW ЕТ ROSS, 1965 (RHODOPHYTA)

ИЗ КОЛЛЕКЦИИ МОРСКИХ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ИНСТИТУТА БИОЛОГИИ МОРЯ ИМ. А.В. ЖИРМУНСКОГО

ДВО РАН1

© 2014 г. К. В. Ефимова, М. А. Крещеновская, Н. А. Айздайчер, Т. Ю. Орлова

Институт биологии моря им.А.В.ЖирмунскогоДВО РАН, Владивосток 690041 e-mail: xengen88@gmail.com, mkreshenovskaya@gmail.com

Статья принята к печати 22.05.2014 г.

Приведены результаты сравнительного генетического и ультраструктурного исследования трех клонов микроскопической красной водоросли Porphyridium purpureum из коллекции культур морских микроводорослей Института биологии моря им. А.В. Жирмунского (ИБМ) ДВО ЕАН. Установлено, что все клоны, имеющие разные районы происхождения, продемонстрировали высокую степень сходства как по трем исследуемым рибосомаль-ным генам ядерной ДНК (18S рДНК, ITS1-5.8S p,flHK-ITS2, D1-D2 регион 28S рДНК), так и по ультраструктуре. Полученные данные позволят паспортизировать два штамма P. purpureum, впервые выделенных в отечественной практике альгологических исследований.

Ключевые слова: лабораторная культура, микроводоросли, Porphyridium purpureum, рибосомальные гены, ультраструктура.

A genetic and ultrastructural study of three clones of Porphyridium purpureum (Bory de Saint-Vincent, 1797) Drew et Ross, 1965 (Rhodophyta) from the marine microalgae collection of the A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology. К. V. Efimova, M. A. Kreshchenovskaya, N. A. Aizdaicher, T. Yu. Orlova (A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041)

In this paper, we present the results of a comparative genetic and ultrastructural study of three clones of the micro-alga Porphyridium purpureum (Rhodophyta) from the collection of marine microalgae cultures of the A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology. All clones, which have different geographical origin, showed a high similarity in terms of both the ultramicroscopic structure and the nucleotide sequences of the nuclear ribosomal DNA genes (18S rDNA, ITS1-5.8S rDNA-ITS2, D1-D2 region of 28S rDNA). The obtained data are very helpful for the certification of two strains of Л purpureum., which were isolated for the first time in the practice of Russian algological research. (Biologiya Morya, 2014, vol. 40, no. 5, pp. 373-383).

Keywords: laboratory culture, microalgae, Porphyridium purpureum, ribosomal genes, ultrastructure.

Среди небольшого количества одноклеточных красных водорослей, введенных в культуру, Porphyridium purpureum (Bory de Saint-Vincent, 1797) Drew et Ross, 1965 [синоним Porphyridium cruentum (Gray) Nägeli, 1849] представляет особый научный и практический интерес, обусловленный тем, что данный вид является источником разнообразных биологически активных веществ (фикобилипротеинов, внеклеточных сульфополисахаридов, ненасыщенных жирных кислот, особенно эйкозапентаеновой кислоты), имеющих широкое практическое использование (Antia et al., 1970; Ahern et al., 1983; Arad et al., 1985; Mmkova et al., 1996; Fuentes et al., 2000; Гудвилович, 2010). Обладая исключительной экологической пластичностью и толерантностью, Р. purpureum интересен и как модельный объект для изучения физиологии микроводорослей. До настоящего времени отечественные исследования, в том чис-

ле биотехнологической направленности, проводились с использованием штаммов этого вида, изолированных из прибрежных вод Европы и США (Айздайчер и др., 2014). Выделение отечественных штаммов и их идентификация, подтвержденная данными генетического анализа и электронной микроскопии, имеют большое практическое значение для проведения прикладных и инновационных работ с использованием культур микроводорослей на территории России. Полученные результаты в дальнейшем позволят паспортизировать и депонировать единственные на сегодняшний день отечественные штаммы Р. purpureum, поддерживающиеся в лабораторных условиях в коллекции Института биологии моря им. A.B. Жирмунского (ИБМ) ДВО РАН.

В 1972 г. Ott (Ott, 1972) разделил виды рода Porphyridium на основе единственного отличительного признака - окраски пластид. Однако таксономический

1 Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ДВО РАН (№ 12-1-П30-09, 12-III-A-06-093, 12-1- 0-02-020, 12-1-П4-02, 121-П28-03).

статус видов рода Porphyridium остается неясным из-за отсутствия выраженных морфологических характеристик (Gaikwad et al., 2009).

С появлением молекулярно-генетических методов были получены последовательности 18S рДНК для трех известных видов рода Porphyridium: Р. purpureum, P. aerugineum и P. sordidum. Недавно было проведено полногеномное секвенирование Р. purpureum (Bhattacharya et al., 2013). Тем не менее в генетическом банке недостаточно данных по другим молекулярно-генетическим маркерам, которые дополнительно использовались бы для сравнительного анализа и установления филогенетических связей представителей рода Porphyridium. Доступные последовательности ограничиваются лишь участками ядерных генов 18S рДНК и ITS1-5.8S рДНК-1Т82 для Р. purpureum, а также 18S рДНК для Р. aerugineum и Р. sordidum, что осложняет работу, направленную на выявление генетического сходства между видами. Одно из немногих исследований филогенетических взаимоотношений между одноклеточными красными микроводорослями и близкими к ним многоклеточными водорослями было проведено на основе ядерного гена 18S рДНК и гена фотосистемы II хлоропластной ДНК-psb А. Показано, что род Porphyridium является эволюционно более древним среди остальных представителей красных водорослей (Нага et al., 2000).

Ультраструктура Р. purpureum к настоящему времени изучена достаточно полно (Brody, Vatter, 1959; Sperr et al., 1964; Gantt, Conti, 1965; Sommerfeld, Nichols, 1970; Oakley, Dodge, 1974; Lin et al., 1975; Nelson, Ryan, 1988). Одно из первых цитологических исследований было выполнено в конце 50-х годов XX века на культуре клеток этого вида (Brody, Vatter, 1959). Авторами приведены общие сведения об ультраструкгуре вида: описаны хлоропласт, ядро, оболочка, аппарат Рольджи и клеточные включения. Однако наличие митохондрий в клетках Р. purpureum ими не было показано. Позже Рантт и Конти (Gantt, Conti, 1965; Gantt, 1981), расширившие описание клетки Р. purpureum, отметили наличие митохондрий ту-булярного строения, а также мелких гранул на тилакои-дах хлоропласта, впоследствии названных фикобилисо-мами.

Цель настоящей работы - изучение ультраструктуры и молекулярно-генетический анализ рибосомаль-ных генов (18S рДНК, ITS1-5.8S рДНК-1Т82, D1-D2 регион 28S рДНК) ядерной ДНК культур одноклеточной красной водоросли Р. purpureum, впервые полученных в отечественной практике из зал. Восток и Амурского залива Японского моря. Проведен также сравнительный анализ этих культур с клоном, предоставленным Биологическим научно-исследовательским институтом (ВНИИ) СПбРУ, который в списке коллекции данного института приводился как "Porphyridium cruentum (Ag.) Naeg. str. Vischer; Texas-161. CALU-39, среда № 12" (Рромов, Титова, 1983).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА Получение культур Porphyridium purpureum

В работе изучены три клона водоросли Porphyridium cf. purpureum (Rhodophyta) из коллекции культур морских микроводорослей ИБМ ДВО РАН. Клон РР-АВ11 выделен из пробы морской воды, отобранной в октябре 2011 г. в Амурском заливе (43°16' N, 131°89' Е) у побережья г. Владивостока с поверхностного горизонта (0-0.5 м). Соленость морской воды составляла 32.6%о, температура - 10-11°С. Клон PP-V08 выделен из пробы морской воды, отобранной в зал. Восток в июне 2008 г. (42°89' N, 132°75' Е). Культура Р. purpureum (клон РС-85), переданная в коллекцию ИБМ ДВО РАН в 1985 г. из ВНИИ СПбГУ, приводящаяся в списке коллекции данного института как "Porphyridium cruentum (Ag.) Naeg. str. Vischer; Texas-161. CALU-39, среда № 12" (Громов, Титова, 1983), поддерживается в условиях лабораторной культуры с 1985 г. при постоянных условиях на среде Гольдберга в модификации Кабановой (1961).

Исследуемые клоновые культуры РР-АВ11 и PP-V08 были получены с использованием традиционных методов культивирования морских микроводорослей (Ланская, 1971; Орлова и др., 2011).

Генетический анализ

Культуры микроводорослей в экспоненциальной фазе осаждали центрифугированием 5000 об/мин в течение 10 мин, супернатант удаляли, клеточную биомассу использовали для выделения ДНК. Для экстракции и очистки геномной ДНК применяли способ, основанный на СТАВ методе (Doyle, Doyle, 1990), с небольшими модификациями. На стадии лизиса добавление 0.2% 2-меркаптоэтанола заменено на гомогенизацию с помощью стеклянного порошка. Молекулярные маркеры для идентификации и сравнительного анализа микроводорослей подбирали с учетом наличия генных последовательностей в генном банке/NCBI для большинства видов рода. Этому требованию удовлетворяет ядерный ген 18S рДНК, который достаточно хорошо позволяет разделять виды. Тем не менее дополнительно для анализа подбирали маркеры для D1-D2 региона 28S рДНК и ITS1-5.8S p¿HK-ITS2, которые также широко используются в подобных систематических и филогенетических исследованиях. Для амплификации участков 18S рДНК использовали ранее разработанные праймеры и условия к ним (Giribet et al., 1996, 1999; Giribet, Ribera, 2000); для амплификации ITS-региона и D1-D2 региона 28S рДНК использовали праймеры, разработанные Адачи с соавторами (Adachi et al.,1994) (ITSA/ITSB) и Шолин с соавторами (Scholin et al., 1994) (DIR/D2C) соответственно.

Амплификацию всех фрагментов проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержавшей 2.5 мкл 10* ПЦР буфера, 2 мкл 10 мкмоль смеси dNTP's (2.5 мкмоль каждого) и 2.5 мкл каждого праймера (2.5 мкмоль), 10 нг ДНК и 1 ед. Taq ДНК-полимеразы. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе Bio-Rad С1000 (USA) в следующем режиме: 94°С - 3 мин, следующие 35 циклов: денатурация при 94°С - 30 с, отжиг праймеров - 1 мин, элонгация при 72°С - 1 мин 45 с; финальная достро

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком