ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 4, с. 466-478
УДК 576.535
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ КЛЕТОК: НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ДЛЯ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ*
© 2015 г. А. Н. Богомазова1'2, Е. М. Васина1,2, С. Л. Киселев1, 2, М. А. Лагарькова1, 2, О. С. Лебедева1, Е. Д. Некрасов1'2, А. В. Панова1'2, Е. С. Филоненко1'2, Е. А. Хомякова1' 2, Л. В. Цховребова1, И. В. Честков1'2, М. В. Шутова1'2
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991
e-mail: sl_kiselev@yahoo.com 2Центр Сколтеха по исследованию стволовых клеток, Москва 143026 Поступила в редакцию 17.10.2014 г.
Установление функций генов и развитие современных технологий генетических манипуляций предоставили возможность использования генетического репрограммирования для изменения клеточной специализации. Применяя набор генов, кодирующих транскрипционные факторы плюри-потентного состояния, можно репрограммировать любую клетку взрослого организма в эмбриональное состояние, индуцировать в ней плюрипотентность. Такие репрограммированные клетки получили название индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), и они способны заново пройти весь путь онтогенетического развития. Это открывает новые возможности в области изучения фундаментальных механизмов биологии развития, изучения формирования специализированных клеточных типов и всего организма. иПСК, находясь в культуре, могут неограниченно долго сохраняться нетрансформированными и допускают проведение генетических манипуляций при сохранении свойства плюрипотентности. Такое уникальное сочетание свойств делает их привлекательным инструментом для изучения различных патологий и поиска способов их лечения. В представленном обзоре мы рассмотрим основные фундаментальные и практические аспекты биологии иПСК.
DOI: 10.7868/S0016675815040025
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ
Клетки, составляющие разнообразие тканей многоклеточного организма, претерпевают множество делений от момента зарождения организма (оплодотворенная яйцеклетка) до момента его биологической смерти. Начиная с самых ранних этапов развития организма, клетки приобретают все больше черт терминальной дифференциров-ки и постепенно теряют потенциал к превращению в разные специализированные типы. В норме это однонаправленный процесс: любая дифференцированная клетка не возвращается назад, не становится прогениторной или стволовой клеткой. Однонаправленность движения заложена в генетической программе, реализуемой в естественных условиях. Идея эпигенетической регуляции однонаправленного процесса онтогенеза была сформулирована еще в 50-х годах XX столетия Конрадом Уоддингтоном, который предложил и сам термин "эпигенетика" [1]. Успехи биологии последних десятилетий свидетельствуют в пользу того, что мы можем эффективно
* Все авторы внесли одинаковый вклад в написание статьи.
управлять состоянием клетки, изменяя ее функции и специализацию.
В 2006 г. японские исследователи сообщили о получении из терминально дифференцированных клеток (фибробластов мыши) клеточных линий, обладающих свойством плюрипотентности [2]. Это стало одним из наиболее существенных достижений биологии развития последних десятилетий и явило собой начало новой эры исследований, так как с помощью этой технологии удалось развернуть программу развития клеток организма в обратную сторону. Предпосылками к данному открытию послужили развитие технологий получения и культивирования плюрипотент-ных стволовых клеток (ПСК) (эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши и человека [3, 4]), репрограммирование ядра соматической клетки методом переноса ядер (SCNT-somatic cell nuclear transfer) или слияния клеток, а также обнаружение молекулярных механизмов плюрипотентности.
Такахаши и Яманака, проверив различные сочетания 24 транскрипционных факторов, участвующих в приобретении и поддержании плюри-потентного состояния, определили комбинацию факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус (известных те-
перь как "коктейль Яманака"), экспрессия которых в соматической клетке приводила к ее переходу в плюрипотентное состояние. Этот процесс получил название прямого генетического репро-граммирования, т.е. репрограммирования путем прямого воздействия на эпигенетическое состояние взрослой клетки (в отличие от 8СМТ и слияния клеток), а клетки, полученные в результате такого процесса, получили название "индуцированные плюрипотентные стволовые клетки" (иПСК).
Технология репрограммирования оказалась столь универсальной, что позволила получать плюрипотентные клетки не только из различных типов клеток, включая фибробласты кожи, клетки крови [5], нервные клетки [6], эндотелиальные клетки [7], но и из клеток различных организмов: крысы [8], свиньи [9] и др. За разработку технологий репрограммирования соматических клеток в 2012 г. Дж. Гердону (метод 8СМТ) и Ш. Яманака (прямое генетическое репрограммирование) была вручена Нобелевская премия по физиологии и медицине.
Уникальность компонентов "коктейля Ямана-ка" не только в том, что транскрипционные факторы участвуют в поддержании плюрипотентного состояния, но и в том, что некоторые компоненты этого коктейля играют большую роль в регуляции клеточного цикла, пролиферации и эпигенетических характеристик клеток.
Ос14 (Ос13, OTF3/4 или POU5F1) - ключевой фактор плюрипотентности. В процессе развития млекопитающих Ос14 экспрессируется в клетках внутренней клеточной массы бластоцисты, экспрессия исчезает в дифференцированных соматических клетках. Ос14 играет важную роль в нормальном развитии млекопитающих: в эмбрионах мыши, нокаутных по гену белка Ос14, не формировались плюрипотентные клетки внутренней клеточной массы, а эмбрионы погибали после стадии бластоцисты. Плюрипотентным ствол о -вым клеткам необходимо поддерживать белок Ос14 на строго определенном уровне: снижение экспрессии гена этого белка приводит к спонтанной дифференцировке в клетки трофобласта, а увеличение - в клетки примитивной энтодермы.
8ох2 — транскрипционный фактор, содержащий HMG-бокс; уровень его экспрессии очень высок в плюрипотентных клеточных линиях эмбриона на ранних стадиях развития, он экспрес-сируется в эмбриональных и экстраэмбриональных тканях зародыша, в клетках-предшественниках нейральных клеток. 8ох2 регулирует экспрессию Ос14, что свидетельствует о важной роли 8ох2 в поддержании плюрипотентности, образует гете-родимеры с Ос14, контролирующие экспрессию генов, специфичных для ЭСК, таких как иТВ1, и ЕЬх15. Снижение уровня экспрессии 8ох2 в
ЭСК приводит к утрате плюрипотентности и к дифференцировке клеток.
КЖ участвует во многих клеточных процессах, включая развитие, пролиферацию, дифференци-ровку и апоптоз. В развивающихся эмбрионах мыши КЖ экспрессируется в экстраэмбриональных тканях, а затем — в тканях желудочно-кишечного тракта и клетках кожи. В тканях взрослого организма КЖ в основном экспрессируется в терминально дифференцированных клетках эпителия желудочно-кишечного тракта и кожи. Интересно, что уровень экспрессии КЖ в неделя-щихся клетках достаточно высокий, а в активно пролиферирующих клетках экспрессия КЖ практически не обнаруживается. Этот транскрипционный фактор играет важную роль в регуляции пролиферации: так, активация экспрессии КЖ в культивируемых клетках приводит к ингибированию синтеза ДНК и остановке клеточного цикла.
С-Мус — транскрипционный фактор, выполняющий важные функции в регуляции клеточных процессов, таких как пролиферация, дифферен-цировка и рост клеток; один из наиболее часто активируемых протоонкогенов. Было показано, что с-Мус регулирует транскрипцию многих генов посредством нескольких механизмов, в том числе таких, в которые вовлечены ацетилазы ги-стонов, ДНК-метилтрансферазы, ферменты, ре-моделирующие хроматин.
С момента первого применения технология репрограммирования претерпела множество изменений и дополнений, главным образом в связи с низкой эффективностью процесса и совершенствованием протокола для потенциального клинического применения иПСК. Первые модификации были связаны с присутствием в составе "коктейля Яманака" онкогена с-Мус, однако эффективность процесса репрограммирования значительно снижалась при использовании только генов транскрипционных факторов Ос14, 8ох2 и КЖ [10]. Уже в первых работах по изучению технологии репрограммирования было показано негативное влияние процесса старения на эффективность индукции плюрипотентного состояния [11]. Таким образом, важным этапом является выбор клеток для репрограммирования — они должны быть легко доступны и не иметь накопленных повреждений ДНК, как, например, повреждения от УФ и других факторов внешней среды [12].
Доставка генетических факторов с помощью вирусных векторов, которые встраиваются в геном клетки-хозяина, — наиболее эффективный, быстрый и дешевый метод репрограммирования, хорошо отработанный в лабораториях [13].
Тем не менее, чтобы сделать эти клетки безопасными для применения в медицине, предстояло преодолеть проблемы геномной интеграции.
В течение всего нескольких лет было разработано множество методов, снижающих вероятность воздействия трансгенов на геном хозяина, которые основаны на не интегрирующих в геном аденовирусах, транзиторной трансфекции плазми-дами, системе транспозонов piggyback и др. Все эти методы не исключают риска модификации генома. В то же время разработки, направленные на создание клеток, пригодных для клинических исследований и терапии, требовали использования метода с нулевым шансом геномной интеграции. Одним из возможных путей, исключающих внесение генетических модификаций в клетку, могла быть непосредственная доставка в клетку репро-граммирующих белков. Такой метод был разработан на основе технологии проникающих пептидов, сшитых с белками "коктейля Яманака" [14, 15]. Основными ограничениями использования этого метода оказались очень медленная скорость образования иПСК и крайняя неэффективность, а также — необходимость многократного использования больших количеств высокочистых рекомбинантных белков.
Следующий метод, исключающий появление неожиданных модификаций генома, был разработан на основе вектора, выделенного из РНК-сод
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.