БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 19 * № 2 * 1993
УДК 577.112.088.3:543.544
© 1993 г. В. Е. Юиошниченко, А. Н. Вульфсон
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЙ ИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА II.* ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ВЭЖХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РАЗРЕШЕНИЕ
И СЕЛЕКТИВНОСТЬ
Институт биоорганической химии им. М, М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАЯ, Москва
Рассмотрены закономерности эксюпозионно-сорбционных взаимодействий инсулинсодержащих белков с сорбентом в соответствии с химической и пространственной структурой, выполненные на колонке Т8К О 3000 в нативных и денатурирующих условиях. Изучены механизмы частичной сорбции линейных проинсулина и гибридного белка в неденатурирующих условиях и динамика образования £08-белкового комплекса в денатурирующих условиях. Полученные результаты используются для ЭВЭЖХ-анализа основных и промежуточных продуктов практически на всех стадиях технологии получения генно-инженерного инсулина человека.
Эксклюзионная хроматография (ЭХ) — один из видов хроматографии, в котором разделение происходит в соответствии с размером молекул образца в растворе [2 ]. Эксклюзионная ВЭЖХ (ЭВЭЖХ) часто применяется для качественного и количественного анализа белков и пептидов как в широком [3, 4], так и узком [5] диапазонах молекулярных масс и может проводиться как в нативных [6 ], так и в денатурирующих [7, 8 ] условиях. При проведении с помощью ЭВЭЖХ качественного разделения белков необходимо учитывать многие факторы, такие, как концентрация и вязкость наносимого образца [2, 9 ], геометрические [4] и физико-химические [10, 11] параметры сорбентов, условия элюирования (пределы рН [12], температура [13], величина ионной силы раствора [14], концентрация органических модификаторов и денатурирующих агентов [15]), стабильность работы и коррозионная стойкость хроматографической системы [16].
Классическая ЭХ требует минимальных взаимодействий между насадкой колонки и разделяемыми веществами, однако на практике трудно достичь чисто эксклюзионного эффекта в разделении компонентов. Из-за широкого разнообразия химических структур, обычных для образцов белков, может возникать адсорбция в основном ионного, электростатического, гидрофобного и смешанного характера, что уменьшает чисто эксклюзионные влияния [17].
Ионно-эксклюзионные эффекты характерны для элюентов со слабой ионной силой (м < 0,1), когда поверхность сорбента слабо заряжена (большинство экс-клюзионных насадок колонок имеют слабо выраженные анионные свойства [17]) и образец, имеющий заряд того же знака, исключается из пор из-за электростатического отталкивания, а противоположного — задерживается в них. В последнем случае можно говорить об ионной инклюзии [14, 17, 18].
При увеличении ионной силы могут возникать внутримолекулярные электростатические эффекты отталкивания соседних карбоксильных групп вдоль полимерной цепи образца, что вызывает расширение и даже деполимеризацию молекулы [14].
К частичной адсорбции могут приводить водородные связи между поверхностью
* Сообщение I см. [1].
насадки колонки и молекулами белка. В случаях белков большой молекулярной массы или способных к образованию агрегатов адсорбция может быть достаточно сильной из-за множественных контактов. Для ослабления водородных связей используются добавки в элюент гуанидингидрохлорида и мочевины [12].
Гидрофобно-гидрофильные взаимодействия составляют значительную часть всех неэксклюзионных эффектов и обычно могут быть уменьшены при добавлении в подвижную фазу денатурирующих агентов, органических модификаторов (таких, как спирты или гликоли [19], ацетонитрил [13, 20], муравьиная кислота и триэтиламмонийфосфат) или аминокислот [21 ]. Денатурирующая подвижная фаза может быть использована для уменьшения различий в форме белков, для предотвращения их ассоциирования и для солюбилизации полипептидов, плохо растворимых в воде. Поэтому важно заметить, что гуанидингидрохлорид и БОБ, связываясь с глобулярными белками и изменяя их природную конформацию, превращает их в гуанидиновые или БОБ-белковые комплексы [6, 14], радиус гидратации которых — простая функция молекулярной массы.
Гораздо большие проблемы возникают, когда колонка одновременно анионная и гидрофобная. Увеличение ионной силы для уменьшения ионных взаимодействий может увеличивать гидрофобные эффекты, уменьшение ее может привести к обратному результату. Следует сказать, что разделение, выходящее за рамки классического механизма, не всегда плохо. Использование неполярных элюентов, которые увеличивают взаимодействия белков с ЭХ-колонкой, было эффективно при очистке интерферона [22] и других биополимеров [17].
Цель данной работы — изучение механизмов удерживания инсулинсодержа-щих белков в режиме элюирования через эксклюзионную колонку типа ТБК в БХУ, выявление общих закономерностей эксклюзионно-сорбционных взаимодействий этих белков с носителем в соответствии с их пространственной и химической структурой в нативных и денатурирующих условиях. Полученные результаты используются для ЭВЭЖХ-анализа основных и промежуточных продуктов на многих стадиях технологии получения генно-инженерного инсулина человека [ 1 ]. Особую важность представляет анализ субстанции инсулина на содержание высокомолекулярных примесей [23, 24 ], образующихся из-за полимеризации и агрегирования молекул вещества в ходе его получения и при хранении [11].
Хотя диапазон молекулярных масс образующихся инсулинсодержащих белков и их производных составляет 6—17 кДа, в данной работе была использована колонка ТБК О 3000 с размером пор 250 А (диапазон разделения 2—100 кДа). Причин этого выбора несколько. Во-первых, среди разработанных ранее [14] и недавно представленных [25] эксклюзионных колонок для разделения белков этот тип наиболее стабилен и часто применяется [26]. Химическая структура сорбента детально не описана в литературе, однако известно, что это силикагель, частично дезактивированный химически связанным гидрофобным полистиролом [2, 27, 28 ], содержащим некоторое количество гидроксильных групп [29]. Во-вторых, хотя диапазон разделения этой колонки в нативных условиях 10—100 кДа [30], в денатурирующих условиях (БОБ) [31, 32] молекулы белков имеют большие размеры из-за образования БОБ-белковых комплексов [6 ] и диапазон разделения уменьшается до 2—70 кДа [33 ]. В-третьих, в образцах гибридного белка содержались небольшие примеси его димера и других олигомеров, разделение которых было желательно для проверки полученных закономерностей.
Таким образом, так как механизмы удерживания белков на сорбентах с одинаковым химическим покрытием, но с разными диаметрами пор несколько различаются [14], небольшое различие результатов, полученных на разных колонках, может исказить общую картину зависимостей удерживания. При элю-ировании всех инсулинсодержащих белков и их производных в различных условиях, но на одной колонке можно в тонкостях выявить закономерности разделения и пути его оптимизации.
Из-за многообразия элюирующих систем при обработке результатов удобнее
0,8
0,5
0,4
ОМ
Л.
0,1 0,4
[Ш-сросфат\, М
Рис.
1,0
0,9
0,8
О, 7
0,6
а
Рис. 2
Рис. 1 Зависимость К^ инсулинсодержащих белков от концентрации Na-фocфaтнoro буфера в качестве подвижной фазы. Колонка Т8К О 3000 (0,75x30 см), скорость потока 0,5 мл/мин. 1 — инсулин, 2 — проинсулин, 3 — денатурированный проинсулин, 4 — проинсулин-8-сульфонат, 5 — линейный гибридный белок, 6 — ренатурированный гибридный белок, 7 — гибридный белок-.5-сульфонат
Рис. 2. Изменение Кл инсулинсодержащих белков при добавлении в 0,1 М Иа-фосфатный буфер 0,2 М ИзС! или N82804. Линии (штриховые для ЩС1 и сплошные для Ка^СЫ соединяют значения Кс1 соответствующих белков в отсутствие (I) и при добавлении солей (II). Условия и обозначения см. рис. 1
пользоваться значениями не времени или объема удерживания (У/), а коэффициента распределения (Кс1)'-
К„
V — у 1 — г
где V, — объем элюции образца, — свободный объем колонки, Уе — общий объем удерживания колонки, У1 — ¥0 — внутренний объем пор частиц колонки, г, — время элюции образца, (0 — время элюции веществ, не проникающих в поры сорбента, (е — время удерживания веществ, полностью проникающих в поры сорбента.
Разделение инсулинсодержащих белков в неденатурирующих условиях проводилось для изучения удерживания образцов на колонке в, зависимости от ионной силы элюента и выполнялось при различных концентрациях Ма-фосфат-ного буфера (0,04</< < 0,8) .рН 7,0 (рис. 1), а также в 0,1 М Ыа-фосфате с добавлением 0,2 М ИаС1 (рН 7,0) или 0,2 М N32804 (рН 7,0) (рис. 2). Из рис. 1 видно, что, как и следует ожидать из классического механизма разделения, при увеличении ионной силы элюирующего раствора увеличивается значение Кй, однако характер удерживания разных белков различается. Кроме того, видно,
кй I- /
«а
0,9
3
о.в - г
0.1 - 5 6
о.в
V
7
ч $
6
2
0.5
О Ю 10 30 35 [СН3СМ],%
0.6
7
т
Л
Рис. 3
Рис. 4
Рис. 3. Зависимость Кл инсулинсодержащих белков от концентрации ацетонитрила в подвижной фазе (0,1 М Щ-фосфат, рН 7,0). Условия и обозначения см. рис. 1
Рис. 4. Изменение Кл инсулинсодержащих белков в присутствии 20% МеОН в подвижной фазе (0,1 М №-фосфат, рН 7,0). Линии соединяют значения Кл соответствующих белков в буфере без метанола (I) и в присутствии 20% МеОН (II). Условия и обозначения см. рис, 1
что линейные проинсулин (3) и гибридный белок (5) элюируются позднее, чем их ренатурированные (т. е. «свернутые») аналоги (2) и (6), соответственно имеющие меньший размер в растворе, что является артефактом в эксклюзионной хроматографии. Вероятно, это происходит из-за взаимодействия насадки колонки с БН-группами или «открытыми» участками этих белков. При сульфитолизе этих групп происходит обратный ионоэксклюзионный процесс, в результате чего проинсулин-5-сульфонат (4) и гибридный белок-Б-сульфонат (7) элюируются раньше своих не только линейных, но и ренатурированных аналогов.
Общий заряд белка играет важную роль в неэксклюзионных эффектах. Основные белки (изоэлектрическая точка > 7) обычно образуют ионные связи между аминогруппами белков и силанольными группами на поверхности сили-кагеля
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.