ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 8, с. 857-863
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 576.6:579.881.17
ГЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ Wolbachia pipientis В НАТИВНЫХ И ИНВАЗИВНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ Harmonia axyridis Pall., 1773
(Coleoptera, Coccinellidae)
© 2015 г. И. И. Горячева1, А. В. Блехман2, Б. В. Андрианов1, Т. В. Горелова1, И. А. Захаров1
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 e-mail: iigoryacheva@mail.ru, andrianovb@mail.ru 2Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук, Москва 119334
Поступила в редакцию 07.10.2014 г.
Исследованы распространение и изменчивость репродуктивной симбиотической бактерии Wolbachia pipientis в семи нативных и шести инвазивных популяциях H. axyridis. WOlbachia-инфицирован-ные особи обнаружены в двух инвазивных и двух нативных популяциях. Инфицированность Wolbachia инвазивных популяций H. axyridis показана нами впервые. С использованием системы мульти-локусного типирования выявлены две новые молекулярные формы Wolbachia. Впервые у H. axyridis обнаружена Wolbachia супергруппы А. Обнаруженное генотипическое разнообразие Wolbachia свидетельствует о неоднократных и независимых событиях заражения в эволюционном прошлом H. axyridis.
DOI: 10.7868/S0016675815080032
a-Протеобактерия Wolbachia pipientis — широко распространенный облигатный цитоплазматиче-ский репродуктивный эндосимбионт, который инфицирует до 70% видов артропод [1]. Полученные в последние годы данные о комплексном влиянии Wolbachia на жизнедеятельность насекомых позволяют по-новому рассматривать ее роль в формировании эволюционных преадаптаций к успешной инвазии своих хозяев. Бактерионосительство, обеспечивающее насекомому-хозяину большую пластичность и устойчивость к биотическим и абиотическим факторам окружающей среды, может рассматриваться как благоприятная составляющая процессов адаптации на начальных этапах инвазии.
Идеальной моделью для таких исследований является божья коровка Harmonia axyridis, у которой Wolbachia впервые была обнаружена в 2010 г. [2]. H. axyridis — широко распространенный вид кокцинеллид, обитающий в границах своего на-тивного ареала в России, на севере Казахстана и Монголии, в Северо-Восточном и Центральном Китае, Японии и Корее. В России H. axyridis встречается в Западной и Восточной Сибири, Приамурье, Хабаровском крае, Приморье, на Сахалине и Южных Курильских островах [3—7]. В последние десятилетия H. axyridis превратилась в наиболее популярный объект популяционно-ге-нетических исследований среди инвазивных видов насекомых в связи со стремительной глобальной инвазией на территорию Северной и Южной Америк, Европы и Африки [8]. Многочисленные исследования экологических особенностей вида
пока не привели к пониманию специфических механизмов, обеспечивших столь успешную инвазию. Это заставляет изучать иные особенности Н. axyridis, которые в совокупности могут оказаться "полезными" на начальных этапах инвазии [8]. К числу таких "нестандартных" признаков может быть отнесена и зараженность вида репродуктивными симбионтами, влияющими на соотношение полов в инфицированных популяциях, перераспределение пищевых ресурсов в пользу инфицированных самок при андроциде и снижение вероятности инбридинга.
Цель настоящего исследования — изучение распространения и изменчивости Wolbachia в популяциях нативного и инвазивного ареала Н. аху-ridis. Накопление подобных данных позволит в будущем оценить роль Wolbachia и других эндо-симбионтов в инвазивном успехе Н. axyridis, определять источник инвазии, число событий интродукции и проводить мониторинг инвазионного процесса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор насекомъх. Сбор насекомых был проведен в семи локалитетах нативного ареала, представляющих западную и восточную группы популяций Н. axyridis [9, 10], и шести локалитетах инвазивного ареала вида (табл. 1, рис. 1). Сбор жуков из популяций Денвера, Берлина, Турина, Калининграда и Сочи проводился в размножающихся колониях, из остальных популяций — во время осеннего лета на зимовку. Во всех выборках жуки
Таблица 1. Характеристика выборок H. axyridis
Статус популяций Место сбора Дата сбора Число самок
Инвазивные Денвер (США) Сентябрь 2004 35
Турин (Италия) Октябрь 2006 12
Берлин (Германия) Июль 2008 30
Прага (Чехия) Ноябрь 2011 26
Калининград (Россия) Август 2010 34
Сочи (Россия) Май 2013 42
Нативные Новосибирск (Россия) Сентябрь 2006 26
Горно-Алтайск (Россия) Сентябрь 2005 20
Саяны, 120 км от Абакана (Россия) Октябрь 2011 23
Биробиджан (Россия) Осень 2009 20
Владивосток (Россия) Осень 2009 48
Бухта Троица (залив Петра Великого) Осень 2003 45
Киото (Япония) Май 2010 14
дифференцировались по полу. Из самок для дальнейшего исследования были выделены образцы тотальной ДНК (всего 375 образцов).
Выделение ДНК. Выделение ДНК проводили из брюшка жуков методом фенол-хлороформной экстракции [11].
Амплификация. Для выявления самок, инфицированных Wolbachia, все образцы ДНК были проанализированы методом ПЦР с праймерами, специфичными к фрагменту гена fbpA, используемого в схеме мультилокусного типирования (МЬ8Т) Wolbachia [12]. Результаты амплификации оценивали методом электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.
При положительном сигнале в реакции амплификации проводилось типирование соответ-
ствующего образца по остальным четырем генам системы MLST: gatB, coxA, hcpA, ftsZс праймерами и по условиям, описанным ранее [12]. Для Wolba-chia-положительных образцов из бухты Троица, Саянских гор и Калининграда также была проведена реакция амплификации с праймерами, специфичными к фрагменту гена wsp. В качестве положительного контроля использовалась ДНК Wolbachia — эндосимбионта Adalia bipunctata.
Реакция амплификации проводилась в конечном объеме ПЦР-смеси 25 мкл, содержащей 30— 50 нг тотальной ДНК, 2 мМ MgCl2, 0.2 мМ каждого из dNTP, 4 пМ каждого праймера и 1 единицу TagHS-полимеразы (Евроген, Россия), на термо-циклере AB Veriti 96 well TC (Applied Biosystems, США) в следующих условиях: начальная денатурация — один цикл: 4 мин 95°С, за которой следо-
60°
Рис. 1. Места сборов популяционных выборок H. axyridis.
ГЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ Wolbachia pipientis 859
Таблица 2. Праймеры для мультилокусного типирования (MLST) Wolbachia
Ген Праймеры t20C
gatB gatB F1 5'-GAKTTAAAYCGYGCAGGBGTT-3' gatB_R1 5'-TGGYAAYTCRGGYAAAGATGA-3' 60 57
coxA coxA F1 5'-TTGGRGCRATYAACTTTATAG-3' coxA_R1 5'-CTAAAGACTTTKACRCCAGT-3' 57 54
hcpA hcpA F1 5'-GAAATARCAGTTGCTGCAAA-3' hcpA_R1 5'-GAAAGTYRAGCAAGYTCTG-3' 59 56
ftsZ ftsZ F1 5'-ATYATGGARCATATAAARGATAG-3' ftsZ_R1 5'-TCRAGYAATGGATTRGATAT-3' 57 54
fbpA fbpA F1 5'-GCTGCTCCRCTTGGYWTGAT-3' fbpA_R1 5'-CCRCCAGARAAAAYYACTATTC-3' 62 58
wspA wsp81 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3' wsp691 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3' 55 52
вали пять циклов: денатурация 30 с при 95°С, отжиг 40 с при начальной tx°C с использованием функции автодельта (понижение температуры на 1°С в каждом цикле), полимеризация 40 с при 72°С; затем следовали 34 цикла: денатурация — 30 с при 95°С, отжиг — 40 с при t/С и полимеризация — 40 с при 72°С; затем следовал цикл заключительной полимеризации — 5 мин при 72°С. Температуры отжига и t/С для каждой пары праймеров приведены в табл. 2. Фрагменты, полученные в результате амплификации, были очищены в 1.5%-ном агарозном геле. Элюция фрагментов из геля проводилась с использованием набора для элюции Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit (Zymo Research, USA) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.
Секвенирование продуктов амплификации проводилось с обоих праймеров на приборе ABI PRISM 3500 с использованием реагентов BigDye® Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя.
Выравнивание последовательностей. Последовательности выравнивались с помощью алгоритма MUSCLE [13], реализованного в пакете программ MEGA v. 5.1 [14]. Последовательности по всем пяти генам выравнивались независимо, затем все фрагменты генов каждого образца были объединены в общие искусственные MLST последовательности по 2079 нуклеотидов.
Филогенетический анализ. Филогенетическая реконструкция методом оценки обратных вероятностей была произведена в программе MrBayes v. 3.2.1 [15]. Для каждой части выравнивания использовалась модель GTR+G+I. Параметры модели оценивались независимо во всех частях выравнивания, соответствующих отдельным генам. Реконструкция проводилась в 400 000 поколений и завершилась при стандартном отклонении разделенных частот в 0.002. Первые 25% полученных
реконструкций были отброшены. Оставшиеся дендрограммы использовались для создания кон-сенсусной филогенетической реконструкции с поддержкой ветвей, выраженной в обратной вероятности.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При амплификации всех 375 образцов тотальной ДНК H. axyridis из 13 популяций нативного и инвазивного ареала с праймерами, специфичными к фрагменту генаfbpA, было обнаружено четыре Wolbachia-положительных образца — по одному в выборках H. axyridis из популяций бухты Троица, Саянских гор, Калининграда и Праги. Для идентификации аллельного профиля обнаруженных линий Wolbachia нами было выполнено муль-тилокусное типирование. Для WOlbachia-положи-тельных образцов из бухты Троица, Саянских гор и Калининграда получены фрагменты специфического размера всех пяти генов, используемых при MLST. Образец из Праги не удалось типиро-вать по всем генам, поэтому он был исключен из дальнейшего MLST-анализа. Также были проанализированы последовательности фрагментов пяти MLST-генов Wolbachia — эндосимбионта A. bipunc-tata, использовавшегося нами в качестве положительного контроля. Все полученные последовательности были депонированы в GenBank под регистрационными номерами ID: KM278170-KM278172 и KM288830-KM288841.
Для дальнейшего филогенетического анализа также были использованы аналогичные последовательности 22 линий Wolbachia из базы данных GenBank. В число этих линий вошли Wolbachia — эндосимбионты Coleoptera, эндосимбионты паразитирующих на Coleoptera насекомых и клещей, эндосимбионты модельных объектов — Drosoph
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.