БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 4, с. 462-467
УДК 547.9:577.1:575.224.46
ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ И МУТАГЕННЫЕ СВОЙСТВА БЕТУЛИНОВОЙ И БЕТУЛОНОВОЙ КИСЛОТ
© 2015 г. Т. С. Фролова*, **, #, Т. П. Кукина**, О. И. Синицина***
*Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2 **Институт органической химии СО РАН им. Н.Н. Ворожцова, Новосибирск ***Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск Поступила в редакцию 05.11.2014 г. Принята к печати 14.03.2015 г.
Проведен синтез бетулиновой кислоты из экстракта внешней коры березы (Betula pendula), одним из промежуточных продуктов синтеза была бетулоновая кислота. Оба соединения выделены в чистом виде (95%). С помощью теста Эймса и SOS-хромотеста показано, что исследуемые образцы не обладают мутагенными или генотоксическими свойствами.
Ключевые слова: бетулиновая кислота, бетулоновая кислота, мутагенез, генотоксичность, тест Эймса, SOS-хромотест.
DOI: 10.7868/S0132342315040053
ВВЕДЕНИЕ
Тритерпеновые соединения лупанового ряда являются очень распространенными вторичными метаболитами многих растительных продуктов [1]. Многие нативные лупаны, а так же их синтетические производные, обладают разнообразной биологической активностью и представляют интерес для получения на их основе фармакологически ценных веществ.
Одним из наиболее изученных представителей соединений лупанового ряда является бетулиновая кислота, которая может быть выделена экстракцией из растительного сырья, в частности, из внешней коры березы Betula alba L.; при этом выход целевого соединения составляет 2.5% [2—4]. Более перспективен синтез бетулиновой кислоты из бетулина — основного компонента экстрактивных веществ коры березы разных видов. Выход целевого продукта может достигать 25% от веса коры березы [4]. Бетулиновая кислота проявила ряд положительных свойств в медико-биологических тестах, особенно в экспериментах по исследованию цитотоксичности против онкотранс-формированных клеток [5—7]. Так, обнаружено противоопухолевое действие бетулиновой кислоты in vitro на клеточных линиях рака толстой кишки RKO и SW480, в экспериментах in vivo на мышах пероральное введение препарата данной кис-
Сокращения: NQO — 4-нитрохинолин-1-оксид, МТВЕ — метил-трет-бутиловый эфир, t-BuO2H — трет-бутилгид-ропероксид. # Автор для связи (e-mail: frolova@bionet.nsc.ru).
лоты вызывало существенное торможение роста опухоли [8]. Сообщается и об ингибировании роста опухоли простаты [9]. Мощный цитотоксиче-ский эффект на глиомных клетках дает сочетание бетулиновой кислоты и радио- или химиотерапии [10]. Механизм подобного эффекта в настоящее время объясняют способностью бетулиновой кислоты запускать апоптоз посредством выделения ми-тохондриальных апоптогенных факторов [11]. При этом установлено, что нормальные клетки устойчивы к токсическому действию, что указывает на наличие избирательного эффекта [12—15].
Помимо существенного противоопухолевого эффекта, бетулиновая кислота обладает антиок-сидантными свойствами [16, 17]. Спиртовые экстракты растений, содержащие бетулиновую кислоту, показали противовоспалительное действие [18]. Были проведены эксперименты на крысах по борьбе с ожирением: установлено, что данное соединение ингибирует активность липазы и индуцирует липолиз адипоцитов [19]. Обнаружен антимутагенный [20] эффект экстрактов, содержащих бетулиновую кислоту.
Бетулоновая кислота долгое время рассматривалась лишь как предшественник бетулиновой в синтезах [21], однако недавние исследования выявили для нее ряд полезных свойств: противовирусных, противоопухолевых, антимикробных, гепатопро-текторных и иммуностимулирующих [22—27]. Исследование влияния производных бетулоновой кислоты на вирус гриппа в сочетании с ремантадином показало, что их совместное использование
позволяет уменьшить дозу препарата и снизить побочные эффекты [28].
При таком обширном спектре положительных свойств бетулиновой и бетулоновой кислот, безопасность их применения в терапии до конца не изучена. Согласно принципам Бриджеса [29], одной из первых стадий проверки химических соединений на безопасность являются быстрые бактериальные тест-системы (тест Эймса, SOS-хромотест), однако сведений о проверке бетулиновой и бетулоновой кислот с помощью этих те-стовотстствуют. Мы провели синтез бетулиновой кислоты из бетулина — одного из главных составляющих экстракта внешней коры березы, для получения целевого соединения в количестве, достаточном для микробиологических тестов. Также были протестированы образцы бетулоновой кислоты, являющейся промежуточным продуктом синтеза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез бетулиновой кислоты
Синтез проведен предложенным ранее способом [4] с некоторыми модификациями процесса очистки целевого соединения. В качестве исходного образца использован экстракт внешней коры березы, состоящий преимущественно из бетулина и лупеола. На первом этапе синтеза получена бету-лоновая кислота с использованием реактива Джонса (оксид хрома (VI) в разбавленной серной кислоте и ацетоне). На следующем этапе бетуло-новая кислота восстановлена до бетулиновой с помощью борогидрида натрия. Целевые соединения очищены перекристаллизацией.
Измерены температуры плавления для бетулоновой и бетулиновой кислот, а также сняты ХН- и 13С-ЯМР-спектры; данные совпадают с литературными [30—32]. Полученные образцы обладают чистотой 95% (данные ВЭЖХ и хроматомасс-спектрометрического анализа).
Исследование генотоксических свойств бетулиновой и бетулоновой кислот с помощью SOS-хро-
мотеста. В основе цитотоксических свойств многих соединений лежит их способность вызывать повреждения ДНК, приводящие к блокировке репликации [33]. Для регистрации повреждений подобного рода и идентификации вызывающих их агентов разработан SOS-хромотест. SOS-хро-мотест является количественным колориметрическим методом анализа активности генотокси-нов. Тест основан на индукции в клетках E. coli SOS-ответа, который включает ряд функций, индуцируемых в ответ на повреждение ДНК или остановку ее синтеза. SOS-хромотест позволяет измерять способность различных химических и физических мутагенов индуцировать экспрессию din-генов (генов, индуцибельных в ответ на по-
вреждения ДНК) в E. coli, анализируя активность ß-галактозидазы, структурный ген которой, lacZ, поставлен под контроль промотора какого-либо din-гена [34, 35]. В штамме E. coli PQ37 (F—, thr, leu, his-4,pyrD, thi,galE, galK EIE galT, srl300::Tn10, rpoB, rpsL, urvA, rfa,trp::Muc—, sfiA::Mud(Ap, lac), cts, lacAU169, PhoC), используемом нами в SOS-хромотесте, структурный ген ß-галактозидазы lacZ введен под контроль промотора din-индуцибель-ного гена sfiA, так что ß-галактозидазная активность зависит от экспрессии этого гена и индуцируется при действии на клетки бактерий многих генотоксических агентов.
Анализ заключается в воздействии на клетки E. coli PQ37 предполагаемого генотоксического фактора с последующим определением относительной активности ß-галактозидазы. Этот тест для анализируемых соединений был выполнен согласно стандартной методике [36] с некоторыми модификациями, рекомендованными в работе [37].
Потенциальные генотоксические факторы могут при некоторых дозах ингибировать синтез белка, что приводит к недоопределению индукции ß-галактозидазы. Под генотоксичностью подразумевается способность соединений вызывать повреждения ДНК, приводящие к блокировке репликации. Чтобы скорректировать такое влияние, определяют синтез общего белка в инкубационный период, анализируя параллельно активности ß-галактозидазы и щелочной фосфатазы — конститутивно экспрессируемого фермента. Поэтому отношение активности ß-га-лактозидазы к активности щелочной фосфатазы при одинаковых дозах воздействия отражает индукцию гена sfiA даже в случае ингибирования синтеза белка. Фактор индукции (I(c)) экспрессии гена lacZ (активности ß-галактозидазы) — величина отношения активности ß-галактозидазы к активности щелочной фосфатазы при исследуемой дозе повреждающего фактора к их отношению в его отсутствие, которая отражает величину повреждающего действия данного агента.
SOS-хромотест проведен как с метаболической активацией, позволяющей получить практически полный спектр возможных метаболитов, так и без нее.
В табл. 1 и 2 приведены значения фактора индукции ß-галактозидазы при инкубации тестерно-го штамма с бетулиновой или бетулоновой кислотами, а также с их метаболитами. Тестируемые соединения были взяты в наибольшей доступной концентрации, обусловленной пределом растворимости в DMSO.
В качестве положительных контролей были использованы стандартные мутагены 4-нитро-хинолин-1-оксид (NQO) и бенз[а]пирен в концентрациях, существенно индуцирующих SOS-ответ клеток E. coli PQ37. Следует отметить, что
464
ФРОЛОВА и др.
Таблица 1. Генотоксичность бетулиновой и бетулоно-вой кислот
Соединение (мМ) Дс)ср ± а
DMSO 1
NQO (1.6) 2.96 ± 0.43*
Бетулоновая кислота (10) 0.71 ± 0.15
Бетулиновая кислота (10) 0.83 ± 0.15
* Значения статистически отличаются от контроля с вероятностью P> 0.95.
Таблица 2. Генотоксичность метаболитов бетулиновой и бетулоновой кислот
Соединение (мМ) 1(с)ср ± а
DMSO 1
Бенз[а]пирен (2) 2.77 ± 0.14*
Бетулоновая кислотаакт (10) 1.15 ± 0.12
Бетулиновая кислотаакт (10) 0.83 ± 0.08
* Значения статистически отличаются от контроля с вероятностью P> 0.95.
Таблица 3. Мутагенность бетулиновой и бетулоновой кислот
Соединение (мМ) ^ср ± а
S. typhimurium TA98 S. typhimurium TA102
DMSO 21 ± 4 322 ± 27
NQO (1.6) 93 ± 11* -
t-BuO2H (0.011) - 760 ± 36*
Бетулоновая кислота (10) 18 ± 5 327 ± 28
Бетулиновая кислота (10) 19 ± 4 3220 ± 16
* Значения статистически отличаются от контроля с вероятностью P> 0.95.
Таблица 4. Мутагенность метаболитов бетулиновой и бетулоновой кислот (штамм S. typhimurium TA98)
Соединение (мМ) ^ср ± а
DMSO 60 ± 11
Бенз[а]пирен (2) 154 17*
Бетулоновая кислотаакт. (10) 61 ± 10
Бетулиновая кислотаакт (10) 56 ± 10
* Значения статистически отличаются от контроля с вероятностью P> 0.95.
достоверного отличия между значением фактора индукции для отрицательного контроля и фактора индукции дл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.