МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 5, с. 770- 776
ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 575.832:597.553.2
ГЕНЫ ГОРМОНА РОСТА У РЫБ: ДОКАЗАТЕЛЬСТВА ФУНКЦИОНАЛЬНОСТИ ПАРАЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ У ГОЛЬЦА Salvelinus levanidovi © 2015 г. Д. Н. Каменская1, М. В. Панькова2, Д. М. Атопкин23, В. А. Брыков12*
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук,
Владивосток, 690041
Дальневосточный федеральный университет, Школа естественных наук, Владивосток, 690012 3Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток 690022
Поступила в редакцию 26.01.2015 г.
Принята к печати 19.02.2015 г.
Геном большинства позвоночных содержит одну копию гена гормона роста, в то время как у лососевых в результате одного из этапов дупликации многие гены оказались множественными, в том числе и ген гормона роста. В геноме лососевых ген гормона роста представлен двумя несвязанными паралогичными генами, gh1 и gh2. С целью выяснения возможной функциональности генов gh1 и gh2 гольца Salvelinus levanidovi и выявления различий между ними в настоящей работе проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей этих генов и прилежащих к ним участков. Оба гена содержат по шесть экзонов (I—VI) и пять ин-тронов (A, B, C, D, E), но имеют разную длину. Показано, что экзоны у двух паралогичных генов имеют одинаковый размер, а различия в общей длине обусловлены разной длиной интронов. Кодирующие последовательности обоих генов содержат открытую рамку считывания для белка из 210 аминокислотных остатков. В промоторной области выявлены регуляторные элементы — ТАТА-бокс, A/T-богатые участки, содержащие сайты связывания с гипофиз-специфичным фактором транскрипции Pit-1, а также участки, ответственные за взаимодействие с другими активаторами и инициаторами транскрипции, в частности, с рецепторами гормонов. Полученные данные свидетельствуют о функциональности обоих генов.
Ключевые слова: гены гормона роста, структура, Salvelinus levanidovi, регуляторные участки, сайты связывания с факторами транскрипции.
FISH GROWTH HORMONE GENES: FUNCTIONALITY EVIDENCE OF PARALOGOUS GENES IN LEVANIDOV CHARR Salvelinus levanidovi, by D. N. Kamenskaya1, M. V. Pankova2, D. M. Atopkin2 3, V. A. Brykov1'2' * (1Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far Eastern Division, Russian Academy of Science, Vladivostok, 690041 Russia; *e-mail: vlbrykov@mail.ru; 2Far Eastern Federal University, School of Natural Sciences, Vladivostok, 690012 Russia; 3Institute of Biology and Soil Science, Far Eastern Division, Russian Academy ofScience, Vladivostok, 690022, Russia). In the genome of most vertebrates growth hormone gene is presented in a single copy, while in salmonids after one of the duplication events many genes were multiplied, including growth hormone gene. In salmonids growth hormone gene exists as two unrelated functional paralogous genes, gh1 andgh2. In the present work, comparative analysis of growth hormone genes gh1 andgh2, and adjacent sequences in Levanidov's charr Salvelinus le-vanidovi was performed for determining their functionality and potential differences. The genes structure is the same, both contain six exons (I—VI) and five introns (A, B, C, D, E) but differ in length. The exons comparison showed that the size of each exon in two paralogous genes is identical, and the total length of genes differs due to varying lengths of introns. The coding sequence of both genes contain an open reading frame for 210 amino acids. Regulatory elements were identified in the promoter region of both genes — TATA box, A/T-rich regions containing binding sites, pituitary-specific transcriptional activator Pit-1, regions responsible for interaction with other transcriptional activators and initiators, in particular — hormone receptors. The obtained data indicate that both genes are functional.
Keywords: growth hormone genes, Salvelinus levanidovi, regulatory regions, transcription factors binding sites.
DOI: 10.7868/S0026898415050092
Принятые сокращения: gh1 и gh2 — гены гормона роста 1 и 2 соответственно, Pit-1 - гипофиз-специфичный фактор транскрипции, CRE — элемент ответа на сАМР, GRE — элемент ответа на глюкокортикоиды, RAR/RXR — рецептор ретиноевой кислоты, ERE — элемент ответа на эстрогены.
* Эл. почта: vlbrykov@mail.ru
Дупликации генов играют важную роль в эволюции. Как правило, дуплицированные или ам-плифицированные копии генов находятся под меньшим давлением отбора, накапливают изменения с более высокой частотой и со временем могут приобретать новые функции.
Ген гормона роста в геноме млекопитающих и птиц обычно представлен одной копией, хотя возможны и исключения [1-3]. Структура генов гормона роста у рыб типична для позвоночных и включает шесть экзонов и пять интронов [4-8], реже встречаются гены с пятью экзонами и четырьмя интронами [9-11]. У многих видов рыб ген гормона роста представлен двумя несвязанными функциональными паралогичными генами, gh1 и gh2 [12-14].
Лососевые представляют собой уникальную группу рыб, которая сформировалась в результате события автотетраплоидизации и последующей дивергенции. Таким образом, лососевые являются естественными и относительно недавними полиплоидами [15]. Как следствие, многие гены у представителей этой таксономической группы оказались множественными, в том числе и представленный двумя копиями ген гормона роста [5, 16-20]. Нами проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов gh1 и gh2 и прилежащих к ним участков у гольца 8а1увИ-пш 1ел>ап1йоу1 для выяснения их возможной функциональности и различий между ними.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали одну особь одного из видов гольцов северо-западной части Тихого Океана — гольца Леванидова (S. levanidovi), полученную из коллекции лаборатории генетики ИБМ ДВО РАН.
Амплификацию ДНК проводили в 25 мкл реакционной смеси, включающей 20—50 нг суммарной ДНК, 2.5 мкл 10-кратного буфера для Taq-по-лимеразы (60 мМ Трис-HCl pH 8.5, 1.5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.1% Тритон Х-100), 2.5 мкл смеси четырех dNTP (2.5 мМ каждого), по 2.0 мкл каждого праймера (2.5 мкМ), 1.5 ед. Taq-полимеразы ("СибЭнзим", Россия) и деионизованную воду. Кодирующую область генов гормона роста амплифицировали с использованием пяти пар специфических праймеров, разработанных в лаборатории (табл. 1). ПЦР с праймерами GH1-1/GH1R1 и GH1F4/GH1-2 проводили по схеме: начальная денатурация (94°С, 5 мин), 35 циклов (94°С, 30 с; 51°С, 1 мин; 72°С, 1 мин) и достройка цепей (72°С, 5 мин). ПЦР с праймерами GH1F2/GH1R2, GH1F3/GH1R3, GHtf1/GHtr1 проводили в других условиях: 94°С, 5 мин; 35 циклов (94°С, 1 мин; 55°С, 1 мин; 72°С, 1 мин), 72°С, 5 мин. Каждая пара праймеров обеспечивала амплификацию двух фрагментов ДНК, соответствующих генам gh1 и gh2. Фрагменты двух генов, полученные с праймерами GH1-1/GH1R1, имели сходный размер. Промоторные области генов gh1 и gh2 амплифицировали с использованием пары
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров для амплификации генов gh1 и gh2
№ Область гена Праймеры Нуклеотидная последовательность 5' ^ 3'
1 Кодирующая область GH1-1 GH 1R1 TCATCCTTGGCAATTAAGAGTA CAGCCAGGTTACTTACTGAACT
2 GH 1F2 GH1R2 GACTTCTGTAACTCCGACTC GTTTCTGACTATGAGGCTGT
3 GH1F3 GH1R3 GTCTGATTGAATCCTGGGAG GGAAACCCGTTGCACTTAAT
4 GH1F4 GH1-2 CAACCATGTCTCTGTCACTAAC GTTCTGGTAGTAGTTCCCGTAG
5 GHtf1 GHtr1 AAGCAAATATTGATATGCACAC CCTAATCTGTATATGGGAAACC
6 Промотор GHpf2 GHpr TGATGATAACAAGACCCTGTC TGGTACACTGACTCCCCACT
7 GH2pf1 GH2pr1 TGTCATCTACAGTACCACAGCG TGGCACTAAATTACTTGTTCACTC
8 Терминатор GH1tf2 GH1tr22 GTTCATTGATCAAGACTGTTCC GTAGAGGTCCTTGTGAATTTTAGG
9 GH2tf GH2tr CAAGACTGGTCTCGAGAAAGTC TCCAAGGGACACAATAGGAATGTT
5'
GH1-1 GH1R1 Ex1 Ex2 Ex3 A B
GH1F3 GH1R3
Ex4
GHtf1
GHtr1
Ex5
Ex6
C
D
E
GHpf2
GHpr
GH1F2 GH1R2
GH1F4 GH1-2
GH1tf2
GH1tr22
GH2pf1 GH2pr1 GH2tf GH2tr
Рис. 1. Стратегия амплификации и секвенирования генов gh1 и gh2 S. levanidovi.
праймеров, GHpf2/GHpr и GH2pf1/GH2pr1 соответственно (табл. 1). ПЦР проводили по следующей схеме: начальная денатурация (94°С, 5 мин), 35 циклов (94°С, 1 мин; 55°С, 1 мин; 72°С, 1 мин) и достройка цепей (72°С, 5 мин). Область терминатора амплифицировали с использованием праймеров GH1tf2/GH1tr22 и GH2tf/GH2tr для генов gh1 и gh2, соответственно, при следующих условиях: 94°С, 5 мин; 35 циклов (94°С, 1 мин; 60°С, 1 мин; 72°С, 1 мин), 72°С, 5 мин. Продукты амплификации разделяли в 1.2%-ном агарозном геле, вырезали и использовали для клонирования и секвенирования.
Молекулярное клонирование. Схема клонирования и секвенирования генов gh приведена на рис. 1. Фрагменты ДНК лигировали с помощью набора для клонирования CloneJET™ PCR Cloning Kit ("Fermentas") согласно инструкции изготовителя. Компетентные клетки Escherichia coli, предварительно охлажденные при 4°C (30 мин), трансформировали рекомбинантной ДНК методом теплового шока (42°C, 1 мин). Трансформанты инкубировали в течение 1 ч при 37°C в 1 мл жидкой среды Лурия—Бертани (среда LB) и высевали на твердую LB-среду, содержащую 50 мг/мл ампициллина.
Искомые рекомбинантные молекулы ДНК отбирали по результатам определения размера фрагментов, встроенных в векторную молекулу. Для этого проводили ПЦР-анализ клеточных колоний с праймерами, комплементарными нуклеотидной последовательности вектора. Продукты ПЦР разделяли в 1.2%-ном агарозном геле и осаждали этанолом. Концентрацию очищенной вставки определяли методом электрофореза в агарозном геле.
Секвенирование. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов gh1 и gh2 (рис. 1)
определяли с помощью набора реактивов BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1 ("Applied Biosystems", США) по методике производителя. Использовали праймеры, входящие в состав Clone-JETTM PCR Cloning Kit. Реакцию проводили в следующих условиях: начальная денатурация (96°С, 1 мин), 26 циклов (96°С, 10 с; 55°С, 10 с; 60°С, 4 мин). Последовательности нуклеотидов определяли на автоматическом секвенаторе ABI 3130 xl ("Applied Biosystems") на Кафедре клеточной биолог
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.