ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 438, № 6, с. 829-833
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.1:616.24-006:615.277.3
гены, потенциально ассоциированные с устойчивостью клеток рака легкого к цисплати ну
© 2011 г. К. Н. Кашкин, Е. А. Мусаткина, А. В. Комельков, Е. А. Тоневицкий, Д. А. Сахаров, Т. В. Виноградова, Е. П. Копанцев, М. В. Зиновьева, И. А. Фаворская, Я. А. Каинов, В. Н. Аушев, И. Б. Зборовская, член-корреспондент РАН А. Г. Тоневицкий, академик Е. Д. Свердлов
Поступило 16.03.2011 г.
Производные платины широко применяют для лечения опухолей различного происхождения, в том числе рака легкого. Первым препаратом этой группы был цисплатин, или цис-диами-нодихлорплатина(П). Позже разработаны карбо-платин, оксалиплатин и другие препараты [1]. В настоящее время, несмотря на выраженную токсичность цисплатина, его продолжают применять в сочетании с лекарствами нового поколения для основного или адъювантного лечения рака [2]. По данным литературы это позволяет повысить долю больных, дающих положительный ответ на лечение, до 25—43%, хотя в ряде исследований преимущество комбинированной химиотерапии по сравнению с монотерапией не достигало статистической значимости [1]. В то же время в значительной доле случаев рака легкого применение одной только химиотерапии на основе производных платины оказывается безуспешным. Для эффективного лечения больных необходимы индивидуальный подбор комбинаций лекарственных препаратов и прогностические тесты, основанные на маркерах чувствительности опухолей к конкретным химиопрепаратам, в том числе на экспрессионных маркерах чувствительности к цисплатину.
Механизм действия цисплатина и других противоопухолевых производных платины состоит в образовании в клетке активных двухвалентных катионов, которые взаимодействуют с нуклео-
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина
Российской академии медицинских наук, Москва Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта, Москва
фильными молекулами (глутатионом, белками, РНК, ДНК) и приводят к образованию в них внутри- и межмолекулярных сшивок и моноад-дуктов [3]. Одной из важнейших мишеней платиновых агентов является ДНК, в которой образуются преимущественно внутримолекулярные поперечные сшивки по пуриновым основаниям. В результате этого нарушается репликация и транскрипция ДНК, что в конечном итоге приводит к гибели клеток. Помимо повреждения ДНК, цисплатин вызывает апоптоз клеток путем стресса эндоплазматического ретикулума, реакции на неупакованные белки (unfolded protein response, UPR), путем активации каспаз и других биологических процессов, отвечающих за апоптоз при повреждениях ДНК и нарушениях сверочных точек клеточного цикла [3].
Устойчивость клеток к цисплатину может проявляться на разных уровнях действия препарата. Снижение терапевтической концентрации цисплатина в клетке может быть обусловлено как пассивными механизмами (изменение ионной среды внутри клеток, пониженная проницаемость клеточных мембран), так и активными — например, пониженной экспрессией в клетках транспортера меди CRT1 или низкой активностью Na + K + + АТФ-азы, способствующих поглощению клетками цисплатина [4]. К такому же результату приводит высокая активность некоторых молекулярных транспортеров, откачивающих препарат из клеток во внешнюю среду; наибольшую специфичность к цисплатину проявляют MRP2 и ATP7A/B [3]. Есть данные о значимой роли в устойчивости опухолей к цисплатину механизмов нейтрализации ксенобиотиков тиолсодержащими белками (металлотионенами, глутатион-8-трансфера-зами), дигидродиол дегидроназой и другими. Эффективность связывания цисплатина с ДНК и его эффект снижаются при защелачивании внутриклеточной среды. К пониженной восприимчивости клеток к цисплатину могут приводить гиперактивность ДНК-метилтрансфераз, систем репа-
Таблица 1. Характеристика линий клеток рака легкого
Линия клеток Тканевое происхождение Источник
A549 Карцинома легкого ATCC*
NCI-H292 Мукоэпидермоидная карцинома легкого »
NCI-H460 Крупноклеточный рак легкого »
NCI-H1299 Немелкоклеточный рак легкого, метастаз из лимфоузла »
NCI-H322 Бронхоальвеолярная карцинома легкого, метастаз ECACC**
NCI-H358 Бронхоальвеолярная карцинома легкого »
* Американская коллекция микроорганизмов и клеточных культур (American Type Culture Collection). ** Европейская коллекция клеточных культур (European Collection of Cell Cultures).
рации ДНК (NER, BER, MMR) и гомологичной рекомбинации ДНК, повышенная экспрессия ферментов метаболизма нуклеотидов (тимидилат синтазы, дигидропиримидин дегидрогеназы), а также активность некоторых ДНК-полимераз (ß, П, Z, 0, которые толерантны к платиновым аддук-там и сшивкам между азотистыми основаниями [3, 4]. Устойчивость к цисплатину могут проявлять клетки с дефектами механизмов апоптоза (p53, p21WAF, каспаз и других) или с избыточной активностью механизмов, препятствующих апо-птозу (например, bcl-2, Mcl-1, IAP, Xiap). С устойчивостью клеток к цисплашну и другим противоопухолевым препаратам коррелирует высокая экспрессия рецепторов эпидермального фактора роста EGFR и ErbB2, рецепторов внеклеточного матрикса (интегринов, CD44), а также некоторых факторов роста [4]. Реакцию клеток на цисплатан определяют белки-шапероны, сигнальные пути PI3K/Akt/mTOR, каскад митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK), некоторые p53-зависи-мые пути и ряд других механизмов, связанных с клеточным циклом, апоптозом и метаболизмом/репарацией ДНК [4]. Таким образом, устойчивость клеток к цисплатину представляет собой сложный признак, определяемый множеством генов и взаимодействий кодируемых ими продуктов. Несмотря на обширную информацию относительно молекулярных механизмов воздействия производных платины на клетки и устойчивости к ним, до сих пор не определены маркеры, которые позволяли бы с уверенностью прогнозировать успех лечения больных раком легкого этими препаратами. Практическое значение генов ERCC1, BCRP, BRCA1 и некоторых других, предложенных в качестве экспрессионных маркеров
устойчивости рака легкого к цисплатину, остается под вопросом [4].
Авторы ряда исследований попытались с помощью микрочипов определить набор генов, экспрессия которых коррелирует с устойчивостью к цисплатину клеток в культуре [5—8] и в опухолях легкого [9, 10], для использования их в клинической практике для прогноза устойчивости. Оказалось, что наборы генов, характеризующие хемо-резистентность клеток и прогностические показатели, в разных работах различаются. Тем не менее некоторые общие каскады внутриклеточных сигналов, к которым относятся эти гены, удается выявить [11].
Следует отметить, что гены, экспрессия которых коррелирует с лекарственной устойчивостью клеток в культуре, могут быть неинформативными для предсказания индивидуального ответа больных на химиотерапию в клинических испытаниях [12]. Однако исследования хеморези-стентности рака только на клинических образцах тканей дают неоднозначные результаты из-за генетического полиморфизма молекулярных систем хеморезистентности у онкологических больных и режимов химиотерапии, которые включают, как правило, несколько лекарственных препаратов.
С целью поиска новых молекулярных маркеров и механизмов лекарственной устойчивости опухолей мы исследовали взаимосвязь между чувствительностью клеток рака легкого человека к цисплатину и экспрессией широкого спектра генов, используя новую платформу микрочипов — Af-fymetrix Human GeneChip ST1.0, на которой представлены олигонуклеотидные пробы для более чем 28000 мРНК человека.
В качестве биологической модели мы использовали клетки рака легкого шести линий (табл. 1). Хотя чувствительность некоторых линий к различным препаратам известна (http://discover.nci. nih.gov/cellminer/), мы заново определили IC50 цисплатина для всех клеток методом MTT [13], чтобы исключить влияние субкультивирования клеток на их чувствительность к препарату. Для клеток каждой линии учитывали результаты не менее трех значимых измерений (рис. 1).
Гибридизацию меченых образцов, приготовленных из суммарной РНК клеток, проводили на оборудовании и по протоколу фирмы "Affyme-trix". Результаты гибридизации обрабатывали по алгоритму RMA с помощью библиотеки xps (Christian Stratowa; http://www.bioconductor.org) в среде R. Сигналы флуоресценции фильтровали по алгоритму I/INI [14], отбрасывая сигналы со случайной вариацией.
По результатам измерений IC50 клетки были условно разделены на две группы: клетки устойчивых линий (NCI-H322, NCI-H292, NCI-H1299) и
£5
w s
о 4
in
и
НЧ
В 3
IS
ce
4 2 с 2
о
5
О
ГЕНЫ, ПОТЕНЦИАЛЬНО АССОЦИИРОВАННЫЕ
Устойчивые клетки i Чувствительные клетки
831
NCI-H322 NCI-H292 NCI-H1299 NCI-H460
A 549
NCI-358
Рис. 1. Концентрации IC50 цисплатина для клеток рака легкого. Показано среднее значение IC50, стандартная ошибка среднего SEM и условное разделение клеток на группы по чувствительности к цисплатину. По абсциссе линии клеток.
клетки чувствительных линий (NCI-H460, A549, NCI-H358), рис. 1. По результатам гибридизации с микрочипами мы отобрали 17 проб, для которых различия между пограничными значениями флуоресценции (показателем экспрессии) в двух группах различались не менее, чем в два раза. В устойчивых клетках сигналы, удовлетворяющие этому условию, получены от проб ARNTL2, CYR61, KIAA1244, CCNC, ARG2 и SLC44A5, а в чувствительных - от проб CDR1, TFPI, SPP1, DNAJC12, EPHX1, SNRPN, SELENBP1, GjFPT2, ACSM3, SMOX, CRIP1. Кроме того, мы определили коэффициенты корреляции Пирсона (R) между показателем экспрессии генов в клетках всех шести линий с IC50 цисплатина и отобрали гены с R > 0.9 и R < -0.9. Объединив гены, отобранные двумя способами, мы составили два набора генов, экспрессия которых ассоциирована с устойчивыми и чувствительными к цисплатину фенотипами клеток РЛ.
С целью исследования возможных механизмов, определяющих чувствительность или устойчивость клеток опухолей к цисп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.