ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 1, с. 26-34
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК 633.521:577.21
ГЕНЫ ЦЕЛЛЮЛОЗОСИНТАЗ, КОНТРОЛИРУЮЩИЕ ФОРМИРОВАНИЕ
ВОЛОКНА ЛЬНА (Linum usitatissimum L.)
© 2014 г. Д. В. Галиновский1, Н. В. Анисимова1, А. П. Райский2, В. Н. Леонтьев2,
В. В. Титок3, Л. В. Хотылева1
1Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, Минск 220072
e-mail: dimgal200@rambler.ru 2Белорусский государственный технологический университет, Минск 220006 3Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси, Минск 220012
Поступила в редакцию 23.04.2013 г.
На основании анализа класс-специфических областей идентифицированы четыре гена целлюлозо-синтаз (LusCesA1, LusCesA4, LusCesA7и LusCesA9), из которых на стадии быстрого роста растений льна LusCesA4, LusCesA7и LusCesA9экспрессируются в стебле, LusCesA1 и LusCesA4 — в апикальной части растений и LusCesA4 — в листьях. Показано, что экспрессия генов LusCesA7 и LusCesA9 специфична для стеблей льна-долгунца и, вероятно, влияет на качество льноволокна.
DOI: 10.7868/S0016675814010056
Для получения волокна лен выращивается человеком уже более 10 тыс. лет [1]. И в настоящее время льноволокно востребовано в текстильной промышленности, а также в производстве композитных материалов [2]. По сравнению с другими природными волокнами (шерсть, хлопок) лен обладает рядом преимуществ, важнейшие из которых — высокая механическая прочность и гигроскопичность. Эти свойства обусловлены особенностями структуры льноволокна, которое состоит из мельчайших трубочек с толстыми стенками, называемых элементарными волокнами. С биологической точки зрения элементарные волокна являются клетками флоэмы с гипертрофированной клеточной стенкой. По химическому составу основное вещество льноволокна — целлюлоза, которая определяет его физико-химические свойства и технологические характеристики. Содержание целлюлозы в зрелом волокне может достигать 70% его массы [3]. Изучение процессов биогенеза вторичной клеточной стенки, а в частности биосинтеза целлюлозы, у льна имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение [4].
Молекулярные механизмы биосинтеза целлюлозы в настоящее время изучены недостаточно. Известно, что синтез целлюлозных цепей происходит в полиферментных комплексах, называемых целлюлозосинтазными розетками, которые у высших растений представлены в виде встроенных в мембрану шестиугольных структур [5]. Трансмембранная целлюлозосинтазная розетка образована 36 каталитическими субъединицами — целлюлозосинтазами, которые одновременно по-лимеризуют 36 р-(1 —4)-глюкановых цепей, формирующих микрофибриллу целлюлозы [6].
Сложность строения целлюлозосинтазного комплекса не позволяет in vitro воспроизвести этот биохимический процесс и добиться прямой демонстрации ферментативной реакции [7], что затрудняет изучение биосинтеза целлюлозы. До настоящего времени подходы молекулярной генетики остаются наиболее перспективными при изучении синтеза целлюлозы в высших растениях.
Целлюлозосинтазы кодируются CesA-генами, которые у высших растений принадлежат к муль-тигенному семейству. В геноме Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. выявлено 10 генов целлюлозосинтаз [8], у тополя — 16 [9], у риса (Oryza sativa L.) — 13, у пшеницы (Triticum aestivum L.) >50 [10]. Установлены две группы генов целлюлозосинтаз, которые экспрессируются при формировании первичной и вторичной клеточных стенок [11], а также показана тканеспецифичная экспрессия различных представителей мультигенного семейства целлюлозосинтаз [12].
При изучении структуры различных CesA-генов стало ясно, что идентифицировать гены целлюло-зосинтаз можно не только по полноразмерной последовательности гена, но и по последовательности класс-специфической области (Class Specific Region (CSRII)), т.е. по последовательности фрагмента гена [13]. Такие области консервативны у CesA-орто-логов и могут быть использованы для идентификации представителей мультигенного семейства целлюлозосинтаз. Эффективность данного подхода была продемонстрирована на осине [14].
Наши работы направлены на изучение роли отдельных CesA-генов в процессе формирования льноволокна. Поскольку льняное волокно полу-
Таблица 1. Праймеры, использованные в работе
Праймер Нуклеотидная последовательность, 5' —- 3' Назначение Ссылка
F_A6_302 R_A6_302 ttattgctgtccagagagag agaaccatatactggcaaga Проверка синтезированной кДНК льна [16]
HVR2F HVR2R tgytatgtycagttyccwc ganccrtaratccaycc Амплификация СБКЛ-обласш [14]
M13/pUC sequencing primer (—20), 17-mer M13/pUC revers sequencing primer (—26), 17-mer gtaaaacgacggccagt caggaaacagctatgac Проверка наличия вставки в плазмиде рТ/57Я [18]
чают из стеблей льна-долгунца, мы предполагаем, что гены целлюлозосинтаз, функционирующие в данном растительном органе, контролируют образование льноволокна и влияют на его качественные характеристики. Цель данной работы — идентификация генов целлюлозосинтаз, специфически экспрессирующихся в стеблях растений льна-долгунца.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования. Объект исследования — сорт льна-долгунца Блакгт (Беларусь). Для анализа использовали стебли, листья и апикальную часть льна на стадии быстрого роста (41-е сутки со дня посева в открытом грунте).
При отборе растительного материала у растений удаляли корень, а надземную часть разделяли на апикальную часть выше "точки слома", стебель ниже "точки слома" и листья с участка стебля ниже "точки слома". Из отобранных проб массой ~100 мг по методике с использованием TRI REAGENT™ выделяли общую РНК [15]. Очистку РНК от ДНК проводили с помощью фермента ДНКаза1 (Fermentas, Литва), после чего препараты РНК растворяли в 100 мкл воды, не содержавшей РНКазы. Качество полученных препаратов контролировали спектрофотометрически.
ПЦР и методы клонирования. Для ферментативного синтеза кДНК посредством обратной транскрипции в качестве матрицы использовали аликвоту, содержавшую ~5 мкг РНК, очищенной от ДНК, а также праймеры Oligo(dT)18 и набор RevertAid H Minus First Stand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Для тестирования качества полученной кДНК проводили амплификацию с прайме-рами F_A6_302 / R_A6_302 (табл. 1).
Для амплификации CSRII использовали праймеры, предложенные Liang, Joshi (табл. 1) [14]. ПЦР проводили при следующих условиях: 4 мин при 95°C; далее 30 циклов: 60 с при 94°C, 90 с при 41°C и 120 c при 72°C, заключительный этап — 10 мин при 72°C. После проведения ПЦР
фрагмент переосаждали холодным 96%-ным этанолом.
Амплифицированные фрагменты клонировали в плазмидный вектор pTZ57R в бактерии E. coli XL1-Blue с использованием InsTAclone™ PCR Cloning Kit (Fermentas). Для отбора клонов, несущих вставку в составе вектора, бактерии высевали на плотную LB-среду, содержавшую 50 мкг/мл ампициллина, 0.002% 5-бромо-4-хлоро-3-индо-лил-р^-галактопиранозида и 0.1 мМ изопро-пил-1-тио-р^-галактопиранозида.
Проверку бактериальных трансформантов на присутствие в плазмиде целевых ПЦР-фрагмен-тов проводили с бактериальных колоний с прай-мерами к полилинкеру плазмиды pTZ57R (табл. 1) с помощью ПЦР при следующих условиях: 4 мин при 95°C; далее 25 циклов: 60 с при 94°C, 60 с при 51°C и 60 c при 72°C; заключительный этап — 10 мин при 72°C.
Последующее разделение продуктов ПЦР осуществляли с помощью электрофореза. В работе использовали метод горизонтального электрофореза в 1%-ном агарозном геле с использованием Tris-ацетатного буфера.
Секвенирование. В качестве матрицы для проведения секвенирующих реакций использовали плазмидную ДНК, которую очищали с помощью набора GeneJet™ Plasmid Miniprep Kit (Fermentas). Секвенирующие реакции проводили с использованием Big DyeTM Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Очистку продуктов реакции осуществляли путем переосаждения с 96%-ным этанолом и ЭДТА согласно рекомендациям фирмы-изготовителя, после чего продукты секвенирующей реакции осаждали, осадки высушивали и ресуспендировали в 10 мкл HiDi-формамида. Образцы денатурировали при 95°C в течение 2 мин и немедленно охлаждали на льду. Секвенирующий электрофорез проводили на ABI Prism™ 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) при 11 300 В и 50°C с применением соответствующего программного обеспечения. Данные обрабатывали с использованием программного пакета Sequencing Analysis v5.3.0.
1000500-
750500-пн
Рис. 1. Электрофореграмма CSRII генов целлюлоза-синтаз апикальной части (1), листьев (2) и стебля (3) льна-долгунца. М1 — маркерные фрагменты (Gene-Ruler 100 bp DNA Ladder Plus, Fermentas), М2 - маркерные фрагменты (GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Fermentas).
Биоинформатические методы. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программ BLAST 2.2.18+ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), ClustalX 1.83.
Для сопоставления CSRII генов целлюлозосинтаз льна-долгунца с их ортологами из генома A. thaliana (L.) Heynh. использовали последовательности генов целлюлозосинтаз A. thaliana, депонированные в GenBank: AtCesAl - NM_119393, AtCesA2 -NM_120095, AtCesA3 - NM_120599, AtCesA4 -NM_123770, AtCesA5 - NM_121024, AtCesA6 -NM_125870, AtCesA7 - NM_121748, AtCesA8 -NM_117994, AtCesA9 - NM_127746, AtCesAlO -NM_128111. Поиск CSRII в приведенных последовательностях генов осуществлялся с помощью вырожденных праймеров [14]. Выравнивание нуклеотидных последовательностей, расчет их идентичности (на основе попарного выравнивания) и построение филогенетического дерева (алгоритм Saitou and Nei) осуществляли с применением программы AlignX из пакета программ Vec-torNTISuite 7.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Молекулярное клонирование класс-специфических областей генов целлюлозосинтаз, функционирующих в разных частях растений льна-долгунца
Проводили исследование и идентификацию индивидуальных CesA-генов льна-долгунца, а также сравнительный анализ CesA-генов, экспресси-рующихся в стеблях, листьях и апикальной части растений. Гены целлюлозосинтаз идентифицировали методом, основанным на сравнении класс-специфических областей генов целлюлозосинтаз [14], который был адаптирован нами для льна. Данный метод базируется на особенностях строения целлюлозосинтаз растений. Вс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.