= МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ =
УДК 591:594
ГЕТЕРОХРОНИИ В ФОРМИРОВАНИИ НЕРВНОЙ И ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМ В РАННЕМ ПОСТЛАРВАЛЬНОМ РАЗВИТИИ ЗАДНЕЖАБЕРНЫХ МОЛЛЮСКОВ: ОРГАНИЗАЦИЯ ОСНОВНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СИСТЕМ АРКТИЧЕСКОЙ
ДОРИДЫ Cadlina laevis
© 2015 г. О. В. Зайцева*, А. Н. Шумеев*, Т. А. Коршунова**, А. В. Мартынов***
*Зоологический институт РАН, 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., 1 **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26 ***Зоологический музей Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 125009, Москва, ул. Большая Никитская, 6 E-mail: ovzaitseva@inbox.ru Поступила в редакцию 18.07.2014 г.
Впервые с применением лазерной конфокальной микроскопии, гистохимических и иммуноцито-химических методов (выявление F-актина, катехоламинов, ацетилхолинтрансферазы, субстанции P и FMRFамида) в сочетании с классическими гистологическими методами и электронной микроскопией на тотальных препаратах изучены общее строение и закономерности формирования основных органов, нервной, мышечной и пищеварительной систем в раннем постларвальном развитии (от 2 сут до 4 мес.) у голожаберного моллюска Cadlina laevis. Выявлены гетерохронии, проявляющиеся в положительной аллометрии сенсорных органов, ганглиев центральной нервной системы и глоточного отдела пищеварительной системы, относительно общих размеров тела у ювенильных особей по сравнению с взрослыми животными.
DOI: 10.7868/S0002332915030157
В настоящее время эволюция понимается как модификация онтогенеза. Это признается и в классических эволюционных работах (Яблоков, Юсуфов, 1976), и современными сторонниками "evo-devo" (Carroll, 2008). Ключевой феномен, связывающий индивидуальное развитие с эволюционными событиями, — гетерохронии (Webster, Zelditch, 2005). Несмотря на значительный прогресс в понимании онтогенетических основ эволюционного процесса, до сих пор отсутствует широкий синтез между разнообразием организмов (таксономическим аспектом) и их онтогене-зами (Martynov, 2012). Между тем отсутствие информации об индивидуальном развитии может серьезно влиять на качество классификационных систем и филогенетических реконструкций (Martynov, Schrodl, 2011).
Эволюционно пластичные заднежаберные моллюски (Opisthobranchia) демонстрируют широкий спектр адаптаций и являются многообещающей модельной группой (Wagele etal., 2013). Однако большинство исследований на Opisthobran-chia, как и на гастроподах в целом, до сих пор было направлено либо на изучение особенностей их личиночного развития (Thompson 1967; Perron, Turner, 1977; Bickell, Kempf, 1983; Voronezhskaya etal., 1999; Wollesen et al., 2007, 2008), либо на вы-
яснение структурно-функциональной организации их взрослых представителей (Зайцева, 1978, 2000а, б; Boyd et al, 1986; Chase, 1986; Zaitseva, 1997; Croll, 2001 и др.). Данных об общих закономерностях и особенностях формирования и диф-ференцировки основных органов и функциональных систем у моллюсков после метаморфоза в ходе раннего ювенильного развития крайне мало (Marois, Carew, 1990; Croll et al, 1999; Wanninger, 2008, 2009; Kristof, Klussmann-Kolb, 2010).
Явления гетерохронии и аллометрии и их роль в ходе онтогенеза моллюсков остаются практически неисследованными, особенно на ранних этапах их постличиночного (ювенильного) развития.
Цель работы — комплексное морфологическое исследование строения и закономерностей формирования основных органов и функциональных систем (нервной, мышечной и пищеварительной) в раннем постларвальном развитии у массового вида арктических голожаберных моллюсков Cadlina laevis.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор и содержание в лаборатории объектов исследования. Кладки моллюсков и взрослые особи C. laevis (L., 1767) были собраны в середине июля
2013 г. на Белом море в районе биологической станции Зоологического института (ББС ЗИН РАН "мыс Картеш") на глубине 17—20 м. Кладки содержались в лабораторных условиях ~1.5 мес. при 5—10°С до вылупления. Исследования проводили на животных в возрасте от 2 сут до 4 мес. За это время моллюски в лабораторных условиях вырастали от 400 мкм до 1 мм. Ювенильных C. laevis содержали при 5—7°С в искусственной морской воде, которую регулярно брали из морского аквариума с декоративными рыбами и беспозвоночными: мягкими кораллами, актиниями, моллюсками и другими морскими животными. Таким образом, выращиваемые моллюски получали питательные вещества и разнообразный мелкий корм, предназначенный для морских животных.
Известно, что взрослые особи C. laevis питаются губкой Halisarca dujardini (Barbour, 1979), однако в нашей лабораторной культуре на ранних по-стларвальных стадиях моллюски не ели предлагаемую им губку, что, видимо, было связано с еще не полностью сформировавшейся у них пищеварительной системой и радулярным аппаратом. Ранее было показано, что ювенильные дориды Doridella obscura не питаются типичным для взрослых особей кормом — зооидами мшанок. Планктотрофные личинки D. obscura оседают на мшанках и после метаморфоза питаются мелкими водорослями, попадающими на мшанок, пока не достигнут определенных уровня развития и размеров, чтобы атаковать живых зооидов (Perron, Turner, 1977).
Для сравнения в целях выявления гетерохро-ний и аллометрий в развитии моллюсков использовали взрослых особей C. laevis с длиной тела от 1 до 2.5 см. Всего было исследовано 70 ювенильных и 10 взрослых животных. Все сравнения размеров тела и отдельных органов ювенильных и взрослых особей проводили уже на фиксированном материале.
Гистологические исследования. Взрослых моллюсков фиксировали в течение 12 ч при 4°С в жидкости Буэна (Romeis, 1948; Ромейс, 1953) или в 4%-ном параформальдегиде (PFA) P6148 (Sig-ma-Aldrich, США) на 0.01 М фосфатно-солевом буфере (PBS) при pH 7.4. Ювенильных животных фиксировали в 2%-ном PFA 30 мин при комнатной температуре или 2 ч при 4°С. После фиксации в PFA моллюсков промывали в PBS (3 х 10 мин для ювенильных особей и 3 х 30 мин для взрослых), а после фиксации в жидкости Буэна — в 70%-ном этаноле до исчезновения желтой окраски, проводили через серию спиртов возрастающей концентрации, затем через изобутанол и бензол, после чего заключали в парафин. Из парафиновых блоков изготавливали серии срезов толщиной 5—7 мкм, которые окрашивали железным гематоксилином по
Гейденгайну — эозином или азаном по Гейденгай-ну (Romeis, 1948; Ромейс, 1953).
Сканирующая электронная микроскопия. Животных фиксировали в 4%-ном PFA или в 2%-ном глутаральдегиде G5882 (Sigma-Aldrich) на PBS в течение 2—12 ч (в зависимости от размеров животных). Исследовали целых животных и отдельно выделенный у них радулярный аппарат. Для выявления ультраструктуры поверхностного эпителия с него после промывки удаляли слизь (Zaitse-va, Bocharova, 1981). Для этого материал помещали на ночь в 16%-ный раствор глицерина на дистиллированной воде, а затем на 6—12 ч в 20%-ный этанол. После обезвоживания в спиртах и ацетоне материал высушивали в углекислоте методом перехода в критической точке и закрепляли на металлических предметных столиках. На высушенные образцы напыляли платину в условиях форвакуума и исследовали при увеличении от 600 до 15 000 раз с помощью электронного микроскопа FEI Quanta 250 в центре коллективного пользования (ЦКП) "Таксон" (ЗИН РАН).
Гистохимическое выявление катехоламинов. Для окраски целых ювенильных моллюсков использовали формальдегид-глутаральдегидный флуоресцентно-гистохимический метод (FaGlu) Фернесса с соавт. (Furness et al., 1977) в модификации Воронежской с соавт. (Voronezhskaya et al., 1999). Моллюсков инкубировали 2 ч при комнатной температуре в фиксирующем растворе, состоявшем из 4%-ного PFA и 0.5%-ного глутараль-дегида на 0.01 М PBS, рН 7.4. Затем моллюсков размещали на предметном стекле, высушивали 1 ч при комнатной температуре под вентилятором и заключали в 80%-ный глицерин на PBS. Исследование препаратов проводили на конфокальном лазерном микроскопе Leica TCS SP5 в ЦКП "Таксон" при возбуждении флуоресценции 405-нано-метровым лазером.
Использовали также модифицированный метод GIF вызванной флуоресценции моноаминов с помощью глиоксиловой кислоты (De la Torre, Surgeon, 1976). Для этого ювенильных моллюсков инкубировали целиком в течение 1 ч при 4°С в свежеприготовленном рабочем растворе глиок-силовой кислоты, затем размещали на предметных стеклах и сушили сначала 30 мин при комнатной температуре под вентилятором, а затем 30 мин в термостате при 60°С. Высушенные объекты заключали в вазелиновое масло. Рабочий раствор глиоксиловой кислоты приготавливали по прописи: после растворения 92 мг глиоксиловой кислоты G10601 (Sigma-Aldrich) в 1 мл дистиллированной воды (финальная концентрация 1 M), добавляли 92 мг NaHCO3, а после окончания нейтрализации добавляли Hepes (финальная концентрация 0.1 М) и 100 мг сахарозы (финальная концентрация 300 мМ). Исследования препа-
ратов проводили так же, как и в случае применения метода FaGlu.
Двойное флуоресцентное гистохимическое и им-муноцитохимическое выявление мышечных и нервных элементов. Ювенильных моллюсков фиксировали в 2%-ном PFA в течение 30 мин при комнатной температуре, затем промывали и пермеабилизовали по 20 мин в трех сменах 0.3%-ного раствора Triton X-100 в PBS (PBS/Triton). После этого моллюсков инкубировали 30 мин при комнатной температуре в 2.5%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS/Triton (PBS/Triton/BSA) для блокирования неспецифического связывания антител. В качестве первичных использовали антитела к ацетилхолинтрансферазе AB-N34, (Advanced Targeting Systems, США) в разведении 1 : 200, антитела к нейропептидам — субстанции P 20064 (Immunostar, США) и к FMRFамиду 20091 (Immunostar) в разведении 1 : 600. Инкубацию моллюсков проводили в одном из вышеуказанных первичных антител, разведенных в PBS/Triton/BSA, при комнатной температуре в течение 20—30 ч на орбитальном шейкере. Далее моллюсков промывали в PBS/Triton/BSA (3 х 30 мин) при комнатной температуре и переносили в разведенные 1 : 500 в PBS/Triton/BSA вторичные антитела, конъюгированные или с Chromeo 488 ab60314 (Abcam, Великобритания), или с Al
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.