УДК 576.311.347,612.467.1,577.352.53,57.044
ГИБЕЛЬ КЛЕТОК ПОЧКИ ПРИ ВОСПАЛЕНИИ: РОЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И МИТОХОНДРИЙ
© 2013 г. М. А. Моросанова1, 2, Е. Ю. Плотников2, 3, И. Б. Певзнер1, 2, Л. Д. Зорова2, 4, Д. Б. Зоров2, 3*
Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73 2Научно-исследовательский институт митоинженерии Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1 3Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1; *электронная почта: zorov@genebee.msu.su 4Международный лазерный центр Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1 Поступила в редакцию 12.04.2013 г.
Пиелонефрит — инфекционное заболевание, стратегия терапии при котором предполагает применение антибиотиков. Однако бактериальная инфекция почки и мочевыводящих путей сопровождается воспалением и окислительным стрессом, которые входят в число основных факторов, повреждающих почечную паренхиму, и, следовательно, могут служить мишенью для терапевтического вмешательства. Цель представленной работы состояла в выяснении роли митохондриальных активных форм кислорода (АФК) как источника повреждения клеток почки при экспериментальном пиелонефрите. На модели пиелонефрита in vivo и клеточной модели воспаления in vitro изучены механизмы воспаления и роль митохондрий и окислительного стресса в почке. Наблюдали развитие окислительного стресса в клетках почечного эпителия in vitro и их гибель в результате такого стресса. Окислительное повреждение было вызвано лейкоцитами, продуцирующими АФК после взаимодействия с бактериальными антигенами. Существенная роль опосредованного митохондриями окислительного стресса подтверждена на модели экспериментального пиелонефрита in vivo. Обнаружено, что уровень малонового диальдегида — индикатора перекисного окисления липидов [5], повышен в почках крыс с экспериментальным пиелонефритом. Более высокие уровни АФК наблюдались в лейкоцитах крови крыс с пиелонефритом. Антиоксидант SkQ1, адресный для митохондрий, существенно снижал большинство проявлений воспалительного повреждения почки, в частности инфильтрацию нейтрофилов, что указывает на высокий потенциал применения подобных соединений в комплексной терапии пиелонефрита. Суммируя полученные данные, мы высказываем предположение о значимости митохондриальных АФК на разных стадиях патологического каскада при пиелонефрите. Защиту клеток от инфекции можно обеспечить посредством индукции различных механизмов устойчивости и снижения окислительного стресса.
Ключевые слова: пиелонефрит, окислительный стресс, митохондрии, митохондриально-адресован-ные соединения, воспаление.
DOI: 10.7868/S0233475513050113
Основным эффекторным звеном в развитии воспаления и последующей деструкции почечной ткани является инфильтрация лейкоцитов в ответ на бактериальную инфекцию [6]. Эта естественная реакция организма протекает без патологического воздействия на окружающую ткань лишь
Сокращения: АФК — активные формы кислорода, DCF — 2,7-дихлорфлуоресцеин, МПО — миелопероксидаза, ОФД — ортофенилендиамин, DPI — дифенилениодониум, МДА — малоновый диальдегид, ФНО — фактор некроза опухоли, SkQ1 — 10-(6'-пластохинонил)-децилтрифенилфосфоний.
тогда, когда активные формы кислорода (АФК) вырабатываются лейкоцитами в фагоцитарных вакуолях внутри клеток. Однако АФК, при их внеклеточном выбросе, начинают повреждать окружающие клетки почки, приводя к разрушению и нарушению функций почечной ткани. К сожалению, в большинстве случаев бактериальная инфекция вызывает избыточную стимуляцию воспалительного ответа, и окислительный взрыв в нейтрофилах в ответ на патогенные бактерии может влиять на окружающую ткань [13].
Воспалительный ответ включает также выброс локально действующих цитокинов, эйкозанои-дов, активацию системы комплемента и различных повреждающих ферментов, и, наконец, собственно генерацию АФК [14].
Основная роль в повреждении почки отводится мононуклеарным клеткам, т.е. макрофагам и моноцитам [4]. Общий механизм уничтожения патогенов (в случае воспаления при инфекциях) этими клетками состоит в генерации АФК мембранной NADPH-оксидазой [18]. Если снизить уровень инфильтрации почки моноцитами, то проявления фиброза, характерные для прошедшего воспалительного поражения почки, становятся менее выраженным.
Выяснение механизмов развития окислительного стресса в клетках почки при пиелонефрите позволит разработать способы воздействия на эти процессы и методы терапии острого и хронического пиелонефрита и других воспалительных болезней почки.
В представленной работе на модели пиелонефрита in vivo и клеточной модели воспаления in vitro изучены механизмы воспаления, а также роль митохондрий и окислительного стресса в почке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали следующие среды и реагенты: культуральные среды DMEM, F12, эмбриональная бычья сыворотка (FBS), фосфатно-солевой буфер (PBS) — Gibco, США; культураль-ный пластик — Greiner, США. Остальные реагенты были производства Sigma, США.
Получение первичной культуры клеток почки крысы. Почки 1—3-дневных крысят извлекали в стерильных условиях. Почечную ткань измельчали и диссоциировали 0.5% раствором коллагена-зы в течение 30 мин при 37°С. Полученную суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 150 g. Осадок ресуспендировали в ~10 мл среды DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, суспензию. отстаивали в течение 2 мин. При этом осаждались крупные недиссоциированные куски ткани, а су-пернатант переносили в другую пробирку и снова суспендировали. Через 10 мин осаждались почечные канальцы, а отдельные клетки оставались в растворе. Осадок ресуспендировали в DMEM/F12 с добавлением 10% FBS и сажали на 24-луночные планшеты или на покровные стекла в чашках Петри диаметром 35 мм.
Культивирование бактерий. Клетки Escherichia coli штамма № 85 выращивали в условиях ночной культуры на жидкой питательной среде следующего состава: 1% триптона, 0.5% дрожжевого экстракта и 1% хлорида натрия. Среду, содержащую примерно 109 КОЕ/мл (колониеобразующие единицы), центрифугировали при 500 g в течение
3 мин для осаждения бактерий. Для получения лизата бактерий брали осадок от 30 мл ночной культуры и разводили его в 3 мл физиологического раствора (0.9% NaCl). Полученную суспензию автоклавировали в течение 1.5 ч при 120°С и использовали для добавления в среду культивирования почечного эпителия.
Получение лейкоцитов периферической крови.
Кровь получали из яремной вены взрослых самцов крыс с добавлением 1000 Ед гепарина. Гепа-ринизированную кровь (5 мл) медленно наслаивали на 5 мл фиколла-урографина плотностью 1.077 г/см3, после чего центрифугировали (30 мин при 250 g). Эритроциты при этом осаждались, а мононуклеарная фракция лейкоцитов формировала интерфазное кольцо на поверхности фикол-ла. Лейкоциты и часть сыворотки крови переносили в другую пробирку и центрифугировали в течение 3 мин при 100 g. Осадок лейкоцитов суспендировали в 5 мл DMEM/F12. После этого с помощью камеры Горяева подсчитывали число клеток и разводили средой DMEM/F12 до концентрации ~100 000 клеток в 1 мл.
Моделирование пиелонефрита in vitro. Через 2 дня после выделения клеток почки среду с сывороткой заменяли на DMEM/F12. Затем к клеткам почки добавляли лейкоциты в среде DMEM/F12 или среду DMEM/F12 (в контроле). Одновременно добавляли лизат бактерий. Клетки почки и лейкоциты сокультивировали в присутствии бактериального лизата в течение 24 или 48 ч. Для изучения действия различных веществ клетки почки преинкубировали c 100 мкМ раствором Trolox в течение 2 ч или 0.5 мкМ раствором дифе-нилениодониума (DPI) в течение 30 мин перед моделированием пиелонефрита. Дальнейшее со-культивирование также проводили в присутствии этих веществ.
Определение продукции активных форм кислорода. Флуоресцентный зонд 2,7-DCF-DA разводили в среде DMEM/F12 без бикарбоната до концентрации 10 мкМ, добавляли к клеткам почки и инкубировали при 37°C в течение 10 мин. После этого краску отмывали и добавляли DMEM/F12 без бикарбоната.
Определение фактора некроза опухолей а (ФНОа) в среде. В культуральной среде и гомоге-натах почечной ткани ФНОа определяли с помощью тест-набора TNF-а ELISA Ready-SET-Go! (eBioscience, San Diego, CA, США).
Окраска клеток почки аннексином. К клеткам почки добавляли холодный 4% формалин на PBS и инкубировали в течение 15 мин при 4°С (по 1 мл на лунку, по 2 мл на чашку). После этого 2 раза промывали PBS и добавляли аннексин-ФИТЦ в разведении 1 : 50 и выдерживали 30 мин при 25°С.
Конфокальная микроскопия. Микроскопическое изучение клеток почки производилось на лазерном сканирующем конфокальном микроско-
пе LSM510 (Carl Zeiss, Германия) с фирменным программным обеспечением. Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер (полоса излучения 488 нм) и HeNe лазер (полоса излучения 543 нм); флуоресцентное излучение проходило через систему стандартных запирающих фильтров. Изображение получали компьютерным усреднением результатов четырех сканирований. Скорость сканирования, уровень усиления сигнала и разрешение изображения были одинаковыми во всех опытах каждой серии. Толщина конфокальной плоскости составляла примерно 1.5 мкм (pinhole 150 мкм) .
Моделирование острого пиелонефрита j крыс. Исследования проводили на самках белых беспородных крыс с массой тела 180—200 г, содержавшихся в условиях вивария и получавших стандартный рацион питания. Для моделирования острого пиелонефрита крысу наркотизировали хлоралгидратом (300 мг/кг), после чего инфицировали внутриуретрально суспензией бактерий, используя мягкий катетер (Clay Adams, США), при этом инокулят (5 мл/кг, 1 х 108 КОЕ/мл культуры фекальных бактерий крыс) вводили медленно в мочевой пузырь, избегая его вытекания, после чего массировали мочевой пузырь, способствуя попаданию инфекционного агента в почку. Животных контрольной группы не инфициров
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.