УДК 577.24
ГИБЕЛЬ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ, ВЫЗВАННАЯ ЭЛИСИТОРАМИ ГРИБОВ, БАКТЕРИЙ И ВИРУСОВ: ЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ МИТОХОНДРИАЛЬНО-НАПРАВЛЕННЫХ ХИНОНОВ
© 2014 Д.Б. Киселевский1, О.Ю. Фролова2, А.Г. Соловьев3, Ю.Л. Дорохов3 4, С.Ю. Морозов3, В.Д. Самуилов1*
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
биологический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-4309,
электронная почта: vdsamuilov@mail.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
НИИМитоинженерии МГУ, 119991 Москва
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва
4 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991 Москва Поступила в редакцию 27.04.14
Хитозан, частично дезацетилированный хитин, являющийся компонентом клеточной стенки грибов, вызывал гибель эпидермальных клеток (ЭК) в листьях гороха (Pisum sativum L.) и табака Nicotiana tabacum, N. ben-thamiana, регистрируемую по разрушению клеточных ядер. Хитозан-индуцированное разрушение ядер ЭК предотвращалось митохондриально-направленным хиноном SkQ1. Хитозан увеличивал, а SkQ1 снижал активность протеинкиназ у N. benthamiana и гороха и снимал действие хитозана. Хитозан стимулировал образование активных форм кислорода (АФК) в устьичных клетках (УК) гороха. Обработка хитозаном или Н2О2 не вызывала разрушения ядер УК, но приводила к нарушению барьера проницаемости их плазматической мембраны, регистрируемого по флуоресценции пропидия иодида. Разрушение ядер ЭК гороха, которое предотвращалось SkQ1, вызывал бактериальный липополисахарид (ЛПС), но не пептидогликан (ПГ). В листья табака, содержащего N-ген устойчивости к вирусу табачной мозаики (ВТМ), вводили клетки Agrobacterium tumefaciens, несущие генетическую конструкцию с геном хеликазного домена репликазы ВТМ (р50), продукт которого (белок р50) является мишенью продукта N-гена. Это индуцировало гиперчувствительный ответ (ГО), который проявлялся в отмирании листа и подавлялся SkQ3. Обработка пленок эпидермиса табака клетками A. tumefaciens для экспрессии р50 вызывала разрушение ядер ЭК, которое подавлялось SkQ1 или SkQ3. Клетки A. tumefaciens безр50не индуцировали разрушения ядер ЭК. Защитное действие ми-тохондриально-направленных антиоксидантов SkQ1 и SkQ3 свидетельствует об участии митохондрий и образующихся в них АФК в программируемой клеточной смерти (ПКС) у растений, вызванной элиситорами патогенов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: программируемая клеточная смерть, митохондриально-направленные хиноны, хитозан, липополисахарид, пептидогликан, вирус табачной мозаики, устьичные клетки, эпидермальные клетки.
У животных и человека стратегией врожденного иммунитета является распознавание клеточными рецепторами консервативных молекулярных структур больших групп патогенов — PAMP (pathogen-associated molecular patterns — ассоциированных с патогенами молекулярных образов) [1, 2]. Врожденный иммунитет растений имеет три ветви: 1) базальную (горизонтальную) устойчивость, включаемую PAMP (PAMP-
triggered immunity, PTI) или DAMP (damage-associated molecular patterns — ассоциированными с повреждениями молекулярными образами); 2) вертикальную устойчивость, включаемую эффекторами патогенов (effector-triggered immunity, ETI); 3) РНК-интерференцию или за-молкание (silencing) генов — подавление экспрессии генов вирусных и невирусных патогенов [3—7].
Принятые сокращения: АФК — активные формы кислорода; ВТМ — вирус табачной мозаики; ГО — гиперчувствительный ответ; ЛПС — липополисахарид; ПГ — пептидогликан; ПКС — программируемая клеточная смерть; УК — устьичные клетки; ЭК — эпидермальные клетки; DCF — 2',7'-дихлорфлуоресцеин; DCFH-DA — диацетат 2',7'-дихлорфлуоресци-на; ETI — effector-triggered immunity; PAMP — pathogen-associated molecular patterns; PI — пропидий иодид; PTI — PAMP-triggered immunity; SkQ1 — 10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний; SkQ3 — 10-(6'-метилпластохинонил)децил-трифенилфосфоний.
* Адресат для корреспонденции.
1617
К PAMP относятся наружные молекулярные структуры грибов и бактерий, расположенные на поверхности их клеток: хитин грибов, ЛПС наружной мембраны грамотрицательных бактерий, ПГ клеточных стенок бактерий, белок бактериальных жгутиков флагеллин. DAMP — соединения, высвобождающиеся из растения в результате действия гидролитических ферментов патогена. Эффекторы патогена — это агенты, которые нарушают активирующую PTI систему передачи сигналов от рецепторов клеток растений, взаимодействующих с PAMP, или реализацию иммунного ответа при PTI. Их распознавание при ETI обеспечивается ^resistance)^™-ми устойчивости [3, 5, 7, 8].
Пример ETI — взаимодействие ВТМ и табака. Устойчивые к ВТМ сорта табака в качестве гена устойчивости содержат .N-ген, который кодирует белок, отвечающий за узнавание эффектора — хеликазного домена репликазы ВТМ (белка р50) [7, 9].
PAMP, DAMP и эффекторы патогенов объединяют термином «элиситоры». Это агенты, вызывающие иммунную реакцию растений. Важное звено иммунной реакции — гиперчувствительный ответ (ГО), при котором инициируется клеточная гибель в месте внедрения патогена и создается барьер из погибших клеток, препятствующий распространению инфекции по тканям растения. Гибель клеток при ГО по ряду признаков относят к программируемой клеточной смерти (ПКС) и определяют как особую форму гибели клеток, присущей растениям, наряду с основными ее формами: вакуолярной клеточной смертью и некрозом [10—12].
Некоторые исследователи считают, что распознавание PAMP, активирующее PTI, не приводит к развитию ГО, сопровождающегося гибелью клеток инфицированного растения. По их мнению, ПКС инициируется на следующей стадии иммунного ответа в результате взаимодействия продуктов Ä-генов с эффекторами патогенов (ETI), при этом иммунный ответ растения сильнее в сравнении с PTI [10, 13, 14].
ГО сопровождается «окислительным взрывом» — интенсивным образованием АФК клетками растений. АФК (О", Н2О2, ОН') — сильные окислители, которые способны реагировать с различными клеточными компонентами (липи-ды, ДНК, белки), нарушая их функции и вызывая гибель клеток как патогена, так и самого растения. Генерация АФК при ГО происходит в результате активации NADPH-оксидазы плазматической мембраны растений, а также при участии пероксидазы клеточной стенки [15—18].
Митохондрии играют важную роль в апопто-зе — одной из форм ПКС, свойственной клеткам
животных и человека. С одной стороны, из митохондрий высвобождаются белки, инициирующие или способствующие гибели клетки: цито-хром с, флавопротеин AIF (apoptosis inducing factor), Smac/DIABLO (second mitochondrial activator of caspases/direct IAP binding protein with low pI), сериновая протеаза HtrA2/Omi, эндонукле-аза G [19]. С другой стороны, дыхательная цепь в митохондриях генерирует опасные для клетки АФК, вызывающие апоптоз [20, 21]. Митохондрии растений также генерируют АФК [22].
Может ли ПКС при ГО у растений регулироваться митохондриями и образующимися в них АФК? Гибель клеток у растений, в том числе и при ГО, зависит от редокс-состояния убихинона в митохондриях и подавляется митохондриаль-ной альтернативной оксидазой, катализирующей перенос электронов с убихинола на О2, минуя комплексы III и IV дыхательной цепи (ее активация подавляет ПКС) [23—26].
Были синтезированы митохондриально-направленные хиноны, содержащие уби- или пластохинон и его производные, ковалентно связанные декановым или пентановым линкером с проникающими через мембраны катионами. К ним относятся 10-(6'-пластохинонил)де-цилтрифенилфосфоний (SkQ1) и 10-(6'-метил-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний (SkQ3). Поглощение по градиенту мембранного потенциала (Ау) позволяет этим соединениям накапливаться в энергизованных митохондриях [27, 28]. Митохондриально-направленные хиноны в низких (наномолярных) концентрациях проявляли антиоксидантные свойства и защищали клетки животных от АФК-индуцированной гибели [29]. Они могут быть использованы как инструмент для исследования роли митохонд-риальных АФК в ПКС.
Цель работы — испытать элиситоры различных патогенов (грибов, бактерий и вирусов) в качестве индукторов ПКС у растений. Для оценки участия митохондриальных АФК в гибели клеток растений исследовали действие митохонд-риально-направленных хинонов SkQ1 и SkQ3 на ПКС, вызванную элиситорами патогенов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Опыты проводили на листьях табака Nicotiana tabacum cv. Samsun NN, содержащего N-ген, а также на пленках эпидермиса, изолированных с нижней поверхности листьев N. tabacum и N. ben-thamiana или гороха (Pisum sativum L.). Растения выращивали на дневном свету или при периодическом освещении люминесцентными лампами, или металлогалогеновой лампой интенсив-
ностью ~100 мкЕ • м-2 • с-1 (свет — 16 ч, темнота — 8 ч) при 23—28°. Пленки эпидермиса отделяли от листьев пинцетом, помещали в дистиллированную воду и добавляли реагенты, состав которых представлен в подписях к рисункам. Обработку хито-заном проводили при перемешивании пленок эпидермиса в взвеси хитозана на магнитной мешалке. Пленки эпидермиса инкубировали с реагентами в полистирольных планшетах при 22—25°.
После инкубации эпидермис обрабатывали 5 мин фиксатором Батталья (смесь хлороформа, 96%-ного этанола, ледяной уксусной кислоты и 40%-ного формалина в соотношении 5 : 5 : 1 : 1), промывали этанолом 10 мин для удаления фиксатора, инкубировали 5 мин в воде и окрашивали гематоксилином Карацци в течение 20 мин. Окрашенные пленки эпидермиса промывали водопроводной водой и исследовали на световом микроскопе. Определяли долю клеток с разрушенными ядрами и лишенных ядер в расчете на 300—500 обследованных клеток (в 3—4 пленках эпидермиса). Опыты проводили в 2—3 пов-торностях. Приводятся типичные данные, полученные в одной из повторностей.
Активность протеинкиназ определяли по включению [32Р] фосфата из y[32P]ATP в основной белок миелина. Пленки эпидермиса в Tris-бу-фере, рН 6,8, с глицерином, ДДС-Na и меркапто-этанолом нагревали 15 мин при 95°, проводили электрофорез в 10%-ном ПААГ с 0,25 мг/мл основного белка миелина. Отмывали три раза по 30 мин в 25 мМ Tris-буфере, рН
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.