ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2010, № 5, с. 631-636
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 594:575
ГИБРИДИЗАЦИЯ ДВУХ ВИДОВ ДРЕЙССЕН Dreissena polymorpha (Pallas, 1771) И Dreissena bugensis (Andrusov, 1897) В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ
© 2010 г. И. С. Ворошилова*, В. С. Артамонова**, А. А. Махров**, Ю. В. Слынько*
* Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742Ярославская обл., Некоузскийр-н, пос. Борок ** Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 117071 Москва, Ленинский просп., 33
e-mail: issergeeva@yandex.ru Поступила в редакцию 06.04.2009 г.
Дрейссениды характеризуются высоким разнообразием по морфологии раковины. В связи с этим в совместных поселениях не всегда удается определить принадлежность некоторых особей к одному из двух видов Dreissena polymorpha (Pallas, 1771) или Dreissena bugensis (Andrusov, 1897). Возможно, что такие особи могут быть межвидовыми гибридами. Нами проведен анализ видоспецифичных алло-зимных локусов типичных представителей двух видов дрейссенид и предполагаемых межвидовых гибридов. Впервые с использованием генетических методов в естественных условиях выявлен межвидовой гибрид D. polymorpha и D. bugensis. Показано, что материнским видом гибридной особи стала D. bugensis.
Быстрое расширение ареала бугской дрейссе-ны (D. bugensis), которое происходит начиная с 1990-х гг., затронуло как пресноводные водоемы Европы, так и Северной Америки (Журавель, 1967; Антонов, 1993; Spidle et al., 1994; Харченко, 1995; Rosenberg, Ludansky, 1995; Orlova et al., 2003, 2004). По мере проникновения в водоемы, уже населенные D. polymorpha, D. bugensis стала образовывать с ней устойчивые совместные поселения; при этом сроки размножения обеих видов частично перекрываются.
Дрейссениды отличаются высоким разнообразием по форме раковины (Карпевич, 1955; Антонов, 1997), и это существенно затрудняет исследование смешанных популяций D. polymorpha и D. bugensis из-за того, что в них достаточно часто встречаются особи, не обладающие четкими диагностическими признаками того или иного вида. Такие особи были описаны, в частности, в совместных поселениях в Угличском и Рыбинском водохранилищах бассейна Верхней Волги и были предположительно интерпретированы как межвидовые гибриды (Orlova et al., 2003).
В то же время генетические методы (анализ изоферментов и ДНК) показали, что дистанция между этими моллюсками значительна и характеризует их как таксономически валидные виды (Spidle et al., 1994; Stepien et al, 1999).
В ходе специального генетического исследования совместных поселений двух видов дрейссен в Великих озерах Северной Америки взрослых межвидовых гибридов обнаружено не было (Spi-dle et al., 1995), а эксперимент по гибридизации дал неоднозначные результаты. Полученные гибридные личинки погибли, однако осталось не-
ясным, была ли связана их гибель с несовместимостью геномов двух видов моллюсков или это произошло из-за неподходящих условий выращивания личинок (Nichols, Black, 1994).
Цель исследования — выяснение возможного гибридного происхождения нетипичных морф в совместных поселениях двух видов дрейссен Рыбинского водохранилища с использованием методов биохимической и молекулярной генетики.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
С целью выявления гибридов генетическими методами в работе были проанализированы моллюски из смешанных популяций D. polymorpha и D. bugensis Волжского плеса Рыбинского водохранилища, собранные на станциях Глебово (58°00' с.ш.; 38°26' в.д.) и Коприно (58°05' с.ш.; 38°18' в.д.).
По форме створок раковины все исследованные особи отчетливо дифференцировались на три дискретные морфологические группы — типичные D. polymorpha, D. bugensis и особи, имевшие нетипичный морфотип, которых относили к группе вероятных межвидовых гибридов (рис. 1).
Для предполагаемых гибридов были характерны следующие морфологические признаки: в передней трети раковины четко выражен киль, что характерно для D. рolymorpha, но располагается он ближе к спинному краю. В остальной части раковины киль закруглен и проходит ближе к середине створки — признак, отличающий D. bugensis (рис. 1).
Всего методами аллозимного анализа и анализа полиморфизма длины рестриктных фрагментов (ПДРФ) локуса COI митохондриальной ДНК
(а)
ВОРОШИЛОВА и др. (б)
(в)
Рис. 1. Створки раковин дрейссенид: а — D. bugensis, б — гибрид D. bugensis х D. polymorpha, в — D. polymorpha.
(мтДНК) было изучено 37 экз. дрейссенид. Среди них присутствовали 10 экз. типичных D. polymorpha, 11 — D. bugensis и 16 особей, имевших нетипичный морфотип.
Собранный материал хранили в низкотемпературном холодильнике при —70°С, для аллозим-ного анализа использовали преимущественно ткани жабр дрейссен. Электрофорез ферментов проводили в 12.5%-ном крахмальном геле с использованием морфолинцитратной буферной системы (рН 6.8) (Clayton, Tretiak, 1972) или в 7.5%-ном по-лиакриламидном геле с использованием трис-ЭДТА-боратного буфера (Peacock et al., 1965). Гистохимическое окрашивание выполняли по методикам (Aebersold et al., 1987).
Для выявления гибридов использовали алло-зимные локусы, которые согласно данным (May, Marsden, 1992; Spidle et al., 1994; Андреева и др., 2001), могли оказаться видоспецифичными для D. polymorpha и D. bugensis или локусы, частоты аллелей которых существенно различались у этих двух видов (общий растворимый белок (GP*), ма-латдегидрогеназа (MDH-1*, MDH-2*), фосфо-глюкомутаза (PGM*), 6-фосфоглюконатдегидро-геназа (6-PGD*), малик-энзим (MEP-2*), эстера-за (EST-2*)).
При определении видовой принадлежности материнского вида, что было особенно важно в случае предполагаемых гибридов, применяли метод анализа ПДРФ локуса СО1 митохондриаль-ной ДНК (мтДНК). Ранее было показано, что нуклеотидная последовательность фрагмента этого локуса, длиной 619 пн, различается у двух видов дрейссен на 16—17% (Baldwin, 1996).
Для выявления диагностических сайтов рестрикции нами сопоставлены взятые из международной базы данных GenBank нуклеотидные последовательности D. polymorpha (AF510510) и D. bugensis (DQ 840132). Для подтверждения диагностической значимости сайтов рестрикции Dra I и Rsa I с помощью программы BLAST (NCBI, GenBank) проанализирован полиморфизм всех имеющихся в GenBank нуклеотидных последовательностей локуса COI для этих видов дрейссенид (D. polymorpha: AF120663, AF474404, AF479636, AF492005, AF510508—AF510510, AM748975-AM748977, AM748985, AM748986, AM748988-AM748990, AM748997, AM748999, AM749001, DPU47653, DQ840121-DQ840125, EF414493-EF414495,
EU484431-EU484435, EU484437-EU484456; D. bugensis: AF096765, AF479637, AF495877, AF510504, DBU47650, DBU47651, DQ840132, EF080861, EF080862, EU484436, EU604834, EU651840).
ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции из замороженных тканей моллюсков. Для синтеза фрагмента, содержащего сайты рестрикции по Dra I и Rsa I, диагностические для двух видов моллюсков, использовали праймеры 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' и 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3' (Folm-er et al., 1994).
Синтез вели на амплификаторе "Терцик" (ДНК-Технология, Москва) в 25 мкл буфера для амплификации фирмы "Fermentas" (Литва): 10 мМ трис-HCl (pH 8.8 ); 50 ммоль KCl, 1.5 - 2 ммоль MgCl2; 0.08% Nonidet P40 (состав буфера приведен до данным фирмы-изготовителя). Смесь для амплификации содержала 100-300 нг
(а)
Аллели MDH-1* 120 100
MDH-2* 100 115
I § 140
145
PGM *
100 111 125 145 154
Рис. 2. Аллели аллозимных локусов малатдегидрогеназы (MDH-1*, MDH-2*) (а) и фосфоглюкомутазы (PGM*) (б) в популяциях D.polymorpha (1—10 дорожки), D. bugensis (27—37 дорожки) и их предполагаемых гибридов (11—26 дорожки).
тотальной клеточной ДНК (содержание ДНК оценивали спектрофотометрически), по 10 пмоль каждого праймера, по 200 нмоль каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов и 0.5—1 ед. Taq-по-лимеразы (Бионем, Москва). Программа амплификации включала в себя этап первоначальной денатурации ДНК — 4 мин., 95°С; 35 циклов синтеза ДНК: 95°С - 50 с., 56°С - 50 с., 72°С - 1 мин, а также этап конечной элонгации: 72°С, 10 мин.
Рестрикцию полученного фрагмента проводили в буферах, рекомендованных производителем рестриктаз (Promega, США). Продукты рестрикции анализировали в 2%-ном агарозном геле с использованием трис-ацетатного буфера (40 ммоль трис-ацетат; 2 ммоль ЭДТА, рН 8). В качестве эталонных образцов длин фрагментов ДНК использовали двунитевые маркеры с шагом 50 п.н. в диапазоне от 50 до 800 п.н. с дополнительным фрагментом длиной 1800 п.н. (50 bp DNA Step Ladder, Promega). Гели окрашивали бромистым этидием (0.5 мкг/мл) и фотографировали в ультрафиолете (X = 312 нм) цифровой камерой "Kodak" (DC 290 Zoom Didital Camera, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все проанализированные аллозимные локусы были полиморфны хотя бы у одного вида дрейс-сен. В то же время видоспецифичные аллели обнаружены только по локусам MDH-2* и PGM*, что позволяет использовать их для идентификации гибридов. D. polymorpha мономорфна по ло-кусу, который представлен аллельным вариантом MDH-2*100, а у D. bugensis этот локус включает три аллеля: MDH-2*115, MDH-2* 140, MDH-2*145. По локусу PGM* оба вида имеют различные аллели: D. polymorpha - PGM*100, PGM*111, D. bugensis - PGM*125, PGM*145.
Среди предполагаемых гибридов лишь у одной особи были найдены сочетания аллелей аллозимных локусов, подтверждающие ее гибридное происхождение. Она оказалась гетерозиготой по ло-кусам MDH-2*100/115 и PGM*100/125 (рис. 2). Остальные локусы оказались неинформативными для выявления гибридов в популяциях дрейс-сен Рыбинского водохранилища, однако данные по ним не противоречили сделанному выводу. В остальных 15 образцах предполагаемых гибридов
634
ВОРОШИЛОВА и др.
(а)
(б)
Рис. 3. Рестрикция продуктов полимеразной цепной реакции с использованием эндонуклеаз: а — Dra I, б — Rsa I. D. polymorpha (1—5 дорожки), предполагаемые гибриды D. polymorpha х D. bugensis (6—12, 14—19), D. bugensis (20—24), маркер (Fermentas) с шагом 50 пар нуклеотидов (13).
зарегистрированы только аллельные варианты, характерные для Б. Ьщепз18 или общие для двух видов дрейссен (рис. 2).
ПДРФ анализ фрагмента гена СО1 мтДН
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.