ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 4, с. 405-413
УДК 577.112.083
ГИБРИДНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ НА ОСНОВЕ 10-го ДОМЕНА ФИБРОНЕКТИНА ЧЕЛОВЕКА
© 2014 г. Л. Е. Петровская*, #, С. Ш. Гапизов*, **, Л. Н. Шингарова*, Е. А. Крюкова*, Е. Ф. Болдырева*, С. А. Якимов*, Е. В. Свирщевская*, Е. П. Лукашев**, Д. А. Долгих* **, М. П. Кирпичников* **
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва Поступила в редакцию 25.11.2013 г. Принята к печати 24.12.2013 г.
В работе представлен новый тип гибридных молекул, включающих красный флуоресцентный белок mCherry и 10-й домен фибронектина человека типа III (10Fn3) — один из альтернативных каркасных белков, на основе которого могут быть получены рекомбинантные аналоги антител различной специфичности. Сконструированы различные варианты гена, кодирующего гибридный флуоресцентный белок, и изучена их экспрессия в клетках Escherichia coli. Установлено, что расположение mCherry на Ж-конце гибридного белка и предложенная нами модификация его Ж-концевой аминокислотной последовательности способствуют увеличению выхода продукта экспрессии в растворимой форме. На основе предложенной конструкции получен гибридный флуоресцентный белок ChlBF, содержащий аУр3-интегринсвязывающий вариант 10Fn3, и продемонстрирована возможность его использования для визуализации аУр3-интегрина на поверхности эпителиальных клеток MDCK методом конфокальной микроскопии.
Ключевые слова: 10-й домен фибронектина типа III, mCherry, интегрин аУ$3, конфокальная микроскопия.
DOI: 10.7868/S0132342314030129
ВВЕДЕНИЕ
Использование флуоресцентных белков в молекулярной и клеточной биологии является революционным подходом, позволяющим непосредственно наблюдать процессы, происходящие с участием отдельных молекул [1, 2]. Наиболее популярными областями их применения являются визуализация временной и пространственной локализации белков, а также их взаимодействий in vivo. С этой целью проводят конструирование и экспрессию гибридных генов, кодирующих какой-либо из известных флуоресцентных белков и целевой полипептид, под контролем необходимых регуляторных элементов. В большинстве случаев продукт экспрессии, приобретая флуоресцентные свойства, сохраняет специфические функциональные характеристики и локализацию [1].
Сокращения: 10Fn3 — 10-й домен фибронектина человека типа III, FITC — изотиоцианат флуоресцеина; IPTG — изо-пропил^--0-тиогалактопиранозид, GFP — зеленый флуоресцентный белок, sfGFP — суперфолдирующийся GFP, mRFP — мономерный красный флуоресцентный белок, mEGFP — мономерный усиленный зеленый флуоресцентный белок.
#Автор для переписки (тел./факс: +7 (495) 330-69-83; эл. почта: lpetr65@yahoo.com).
Альтернативным инструментом для детекции и визуализации являются гибридные белки, в состав которых входят флуоресцентный белок и полипептид, обеспечивающий связывание с целевой молекулой. В зависимости от поставленной задачи, эта часть гибрида может представлять собой рекомбинантное антитело или его фрагмент [3—9], а также белок А Staphylococcus aureus [10]. Такие молекулы могут быть использованы в качестве реагентов для проведения различных исследований in vitro, включая иммунофлуоресцентный анализ (аналог ELISA), конфокальную микроскопию, флуоресцентно-активированный клеточный сортинг и другие методы. Их основным преимуществом является простота и быстрота анализа, который может быть проведен в одну стадию, а также низкая стоимость производства белка с помощью бактериальной экспрессии.
Несмотря на кажущуюся простоту и удобство конструирования гибридов связывающих и флуоресцентных белков, известно не так много примеров подобных работ. Так, в работах [4—6] описано получение гибридных белков, состоящих из од-ноцепочечного антитела и GFP, путем экспрессии в периплазме бактериальных клеток, однако
406
ПЕТРОВСКАЯ и др.
уровень их синтеза был крайне низким. При экспрессии в цитоплазме Escherichia coli большая часть гибридного белка обнаруживалась в составе нерастворимых тел включения [7]. Использование штаммов, обеспечивающих замыкание ди-сульфидных связей в цитоплазме клеток, привело к увеличению выхода белка в растворимой форме, однако доля активных гибридных молекул осталась невысокой [8].
В работе [9] описано получение полноразмерных молекул IgG, объединенных с "суперфолди-рующимся" GFP (sfGFP). Различные варианты гибридных белков содержали от 2 до 8 молекул sfGFP, что способствовало усилению флуоресцентного сигнала. При внутриклеточной экспрессии в E. coli продукты экспрессии образовывали тела включения, однако использование разработанной авторами технологии ренатура-ции позволило добиться выхода около 50 мг активного гибридного белка из 1 л культуры. В настоящее время трудно прогнозировать, насколько описанный подход окажется эффективным для экспрессии аналогичных гибридов с другими антителами.
Предположительно, основным препятствием на пути получения гибридов связывающих и флуоресцентных белков является различие условий, обеспечивающих их правильный фолдинг. Сворачивание флуоресцентных белков и созревание хромофора требует восстанавливающих условий [11], в то время как для замыкания дисульфидных связей, присутствующих в молекулах антител и их аналогов, необходима окислительная среда [12].
В последнее время перспективным направлением в инженерии связывающих молекул является конструирование искусственных аналогов антител на основе альтернативных каркасных белков. Такие белки отличаются высокой стабильностью и небольшим размером, который обеспечивает более эффективное проникновение в ткани и позволяет использовать их в качестве партнеров в составе гибридных молекул [13]. Одним из наиболее популярных каркасных белков является 10-й домен фибронектина типа III (10Fn3), который обладает небольшим размером (10 кДа), высокой термостабильностью и хорошей растворимостью [14]. Отсутствие остатков цистеина обеспечивает возможность его эффективной экспрессии в цитоплазме бактериальных клеток, что может быть использовано для конструирования гибридных флуоресцентных белков.
Целью нашей работы явилось конструирование гибридного гена, кодирующего 10Fn3 и красный флуоресцентный белок mCherry, изучение и оптимизация его экспрессии в клетках E. coli для обеспечения высокого уровня синтеза белка в цитоплазме клеток бактерий преимущественно в растворимой форме, а также получение на основе
предложенной конструкции гибридного флуоресцентного белка ChIBF, содержащего aVßS-ин-тегринсвязывающий вариант 10Fn3.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Наиболее известным и хорошо изученным флуоресцентным белком является зеленый флуоресцентный белок GFP, выделенный из медузы Aequorea victoria, и его усовершенствованные варианты [1]. Однако известно, что экспрессия GFP и содержащих его гибридных белков в клетках E. coli зачастую сопровождается образованием нерастворимых агрегатов [7, 15]. Кроме того, реагенты, максимум флуоресценции которых лежит в красной области, обладают рядом преимуществ, включая низкий уровень собственной флуоресценции клеток в этой области, более высокую проницаемость тканей для красного света и хорошую совместимость с лазерной техникой для конфокальной спектроскопии. Поэтому мы остановили свой выбор на красном флуоресцентном белке mCherry, который был получен на основе белка DsRed из кораллов рода Discosoma [16]. mCherry представляет собой мономерный белок с максимумом флуоресценции 610 нм, быстрым созреванием и высокой фотостабильностью. Отсутствие способности к димеризации также является преимуществом mCherry, поскольку снижает вероятность агрегации и негативного влияния на функции белка-партнера [1].
Ранее нами был сконструирован искусственный ген 10Fn3, оптимизированный для бактериальной экспрессии [17]. Для объединения генов mCherry и 10Fn3 в единой рамке считывания было проведено их совместное клонирование в вектор для экспрессии на основе рЕТ32а под контролем сильного регулируемого промотора Т7lac. Для обеспечения независимого сворачивания белковых партнеров между кодирующими их генами была добавлена последовательность, кодирующая глицил-сериновый линкер. На З'-конце полученного гибридного гена расположена последовательность, кодирующая гексагистидиновый фрагмент, для последующей очистки при помощи металлоаффинной хроматографии.
На первом этапе работы мы сконструировали ген гибридного белка Fn3Ch, на ^-конце которого должен располагаться полипептид 10Fn3, а на С-конце — mCherry (рис. 1а). Методом белкового электрофореза установлено, что в результате экспрессии этого гена в клетках штамма BL21(DE3) происходит эффективный (до 20% общего клеточного белка) синтез полноразмерного гибридного белка Fn3Ch с подвижностью, соответствующей молекулярной массе 40 кДа (рис. 1г, дорожка 2). Электрофорез аликвот супернатанта и осадка, полученных после обработки биомассы
VSKGEEDNMAII
(а)
l0Fn3 mCherry
MVSKGEEDNMAII
(б) kWWWWWMA I
mCherry l0Fn3
MASSEDVIKE
(в) kWWWWWM I I
mCherry l0Fn3
(г)
66.2
45.0 ^
35.0
25.0
18.4 14.4
кДа M 1 2 3 4
Рис. 1. Экспрессия генов гибридных флуоресцентных белков в клетках E. coli. а — Схематическое изображение гибридных белков Fn3Ch (а), NCherry (б), ChFn3 (в) с указанием ^-концевых аминокислотных последовательностей mCherry. Белым цветом обозначен 10Fn3, серым — глицил-сериновый линкер, штриховкой — mCherry. г — Гель-электрофорез в 13% ПААГ по Лэммли суммарного клеточного белка штамма BL21(DE3) без плазмиды (1) или трансформированного плазмидами pFn3Ch (2), pNCherry (3), pChFn3 (4), после индукции IPTG. М — стандарты молекулярной массы белков (Fermentas).
клеток штамма-продуцента ультразвуком и центрифугирования, показал, что большая часть продукта экспрессии находится во фракции нерастворимых клеточных белков — телец включения (рис. 2). Известно, что как 1(^п3, так и шСИеггу являются хорошо растворимыми белками, поэтому данный результат может объясняться нарушением процесса сворачивания белковых партнеров в составе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.