научная статья по теме ГИДРОФОБНЫЕ И ДОНОРНО-АКЦЕПТОРНЫЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК СТАФИЛОКОККОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ И УСТОЙЧИВЫХ К ВАРНЕРИНУ Биология

Текст научной статьи на тему «ГИДРОФОБНЫЕ И ДОНОРНО-АКЦЕПТОРНЫЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК СТАФИЛОКОККОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ И УСТОЙЧИВЫХ К ВАРНЕРИНУ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 80, № 4, с. 568-570

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

УДК 579.222

ГИДРОФОБНЫЕ И ДОНОРНО-АКЦЕПТОРНЫЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК СТАФИЛОКОККОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ

И УСТОЙЧИВЫХ К ВАРНЕРИНУ © 2011 г. Н. В. Панькова, Т. В. Полюдова, Л. М. Лемкина, В. П. Коробов1

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Поступила в редакцию 27.09.2010 г.

Гидрофобность поверхности является важнейшей характеристикой бактериальных клеток, определяющей процессы их адгезии на границах раздела фаз, взаимодействия с различными соединениями, прикрепления к тканям организма-хозяина, формирования биопленок, проявления вирулентности [1, 2]. Особое значение гидрофобные свойства клеточной поверхности, по-видимому, имеют при взаимодействиях бактерий с антибиотиками, определяя уровень чувствительности или резистентности к этим факторам [3]. Однако сведения о наличии подобных взаимосвязей весьма ограничены. В частности, показано, что развитие устойчивости к окса-циллину [4] и новобиоцину [5] сопровождается снижением гидрофобности клеточных стенок бактерий резистентных штаммов. Значение степени гидрофобности поверхности бактерий в их чувствительности к пептидным антибиотикам не изучено.

Целью работы явился сравнительный анализ уровня гидрофобности и донорно-акцепторных свойств поверхности клеток коагулазонегативных стафилококков (КНС) и чувствительности этих бактерий к низкомолекулярному катионному пептиду варнерину, обладающему выраженным лизи-рующим действием на различные грамположитель-ные бактерии [7].

В работе использовали штаммы КНС из коллекции лаборатории биохимии развития микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН. Бактерии выращивали на среде LB до середины фазы логарифмического роста (OD600 = 0.8). Аликвоты культур центрифугировали ("Sigma" 3К30, при 10000 g, в течение 10 мин; осадки бактерий дважды отмывали 0.15 М раствором NaCl и ресуспендировали в этом же растворе до значения оптической плотности равной 0.18—0.22 (OD600).

Изучение адгезирующей активности бактериальных клеток проводили помощью MATS-тест (Microbial Adhesion to Solvents) [8], с оценкой уровня гидрофобности поверхностей клеток при использовании неполярных растворителей (декан и гексаде-кан), электрод онорно-акцепторных свойств —

1 Автор для корреспонденции (e-mail: korobov@iegm.ru).

сравнением адгезивных способностей микробных клеток в парах одинаковых по поверхностному натяжению полярных и неполярных растворителей: этилацетат (донор электронов)—декан и хлороформ (акцептор электронов)—гексадекан. Различия между результатами, полученными в разных парах растворителей, указывают на наличие электронных до-норно-акцепторных взаимодействий на поверхности бактериальной клетки, а также характеризуют выраженность их гидрофобных и гидрофильных свойств.

В специальные откалиброванные (внутренний диаметр 10 мм) стеклянные пробирки комплекта цифрового спектрофотометра PD-303 ("Apel", Япония) вносили 1.8 мл суспензии клеток, измеряли оптическую плотность и добавляли 0.3 мл соответствующего растворителя. Пробы встряхивали на шейкере Multi-VOrtex V-32 ("Biosan", Латвия) при максимальной амплитуде в течение 90 с. После отстаивания суспензий бактерий до полного разделения фаз (15—20 мин) вновь измеряли оптическую плотность их водных фаз. Величину адгезивной активности бактериальных клеток вычисляли по формуле: Ad% = 100[1 — (A/Aq)], где А и А — оптическая плотность водной фазы суспензии бактерий до и после процедуры встряхивания соответственно.

Антибактериальный пептид варнерин выделяли из среды роста продуцента Staphylococcus warneri IEGM KL-1 как описано ранее [6]. Определение чувствительности стафилококков к варнерину проводили методом двукратных разведений препарата пептида (4 мг/мл) в полистироловых иммунологических планшетах, используя в качестве инокулума суспензии бактерий S. epidermidis 33, содержащие 1.2—1.5 х 106 КОЕ/мл [6]. Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы Excel 2003 (Microsoft Inc., 1999).

Анализ чувствительности штаммов КНС к пептиду позволил разделить их на 2 группы, различающиеся по минимальной ингибирующей концентрации (МИК) варнерина: чувствительные (МИК < 64 мкг/мл) и нечувствительные (МИК > 2048 мкг/мл) к пептиду.

ГИДРОФОБНЫЕ И ДОНОРНО-АКЦЕПТОРНЫЕ СВОЙСТВА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК

(а) Г (б)

569

ла, %

100 г

80 60 40 20

¿Е

гй. к

Л

12 12 12 12 12 12 12 12 12 2989 2991 2992 2932 2988 2903 923 984 751

1 2 1 2 1 2 2957 2966 2984

Рис. 1. Гидрофобные свойства чувствительных (а) и нечувствительных (б) к варнерину штаммов КНС. ла — показатель адгезии, %; 1 — декан, 2 — гексадекан.

ла, % 100

80

60

40

20

(а)

(б)

12 12 12 12 12 1212 12 12 12 12 12 2989 2991 2992 2932 2988 2903 923 984 751 2957 2966 2984

Рис. 2. Донорно-акцепторные свойства чувствительных (а) и нечувствительных (б) к варнерину штаммов КНС. Ла -показатель адгезии, %; 1 — этилацетат, 2 — хлороформ.

Как показали результаты исследований, гидрофобные свойства поверхностей бактерий этих двух групп при детекции их с неполярными (рис. 1) и полярными растворителями (рис. 2) значительно различались. Клетки чувствительных к ванерину штаммов (рис. 1а) при суспендировании в декане или гексадекане, в основном, характеризовались средним и высоким уровнем гидрофобности от 26 до 65.3%, в то время как бактерии нечувствительных штаммов (рис. 1б) были мало-и среднегидрофоб-ными (4.0—54.3%). Самым гидрофобным (65.3%) оказался высоко чувствительный к варнерину штамм 2988(МИК 32 мкг/мл), а гидрофобность ме-

нее чувствительного к пептиду штамма 2903 (МИК 64 мкг/мл) была значительно ниже — 47.5%. Важно отметить, что гидрофобность поверхности используемого в качестве тестерного штамма S. epidermidis 33 (МИК 0.25 мкг/мл) составляла 77.9%. Полученные в этих экспериментах данные позволяют рассматривать уровень гидрофобности поверхности бактериальных клеток в качестве важного фактора, определяющего их чувствительность к варнерину, и, возможно, к другим амфифильным антибиотическим агентам.

Использование полярных растворителей выявило другую отличительную особенность чувстви-

0

0

МИКРОБИОЛОГИЯ том 80 № 4 2011

570

ПАНЬКОВА и др.

Характеристика штаммов КНС по чувствительности к варнерину, гидрофобным и донорно-акцепторным свойствам поверхности бактериальных клеток

Чувствительность бактерий к варнерину Средняя степень гидрофобности, Ad, % Электроно-донорные свойства, % Электроно-акцепторные свойства, %

Декан Гексадекан А^хлороформ А^ексадекан Ad -Ad

Чувствительные 32.1 ± 6.74 50.6 ± 8.65 31.0 ± 8.82 35.4 ± 19.22

Нечувствительные 19.7 ± 12.41 22.6 ± 16.69 20.1 ± 9.51 23.1 ± 17.52

тельных к катионному пептиду бактерий. Как следует из данных, представленных на рис. 2а, бактерии всех штаммов этой группы проявляли высокое сродство к протоногенному растворителю хлофор-му, по-видимому, выступая в качестве источников электроно-донорных компонентов. Уровень бактериальной адгезии для всех штаммов составлял, практически, 80%. Необходимо отметить, что два штамма этой группы (2989 и 2992) одновременно характеризовались и высоким уровнем акцепции электронов этилацетата, что выявляет наличие в клеточных стенках бактерий этих штаммов выраженных нуклеофильных зон. Аналогичная, но выявляемая в значительно меньшей степени, характеристика электроно-донорно-акцепторных свойств поверхностей была обнаружена и у бактерий нечувствительных штаммов (рис. 2б).

Была также предпринята попытка оценки донор-но-акцепторных свойств поверхностей клеток исследуемых штаммов на основании сравнения ре-зультатов,полученных в экспериментах с растворителями, обладающими электроно-донорным (этилацетат) или акцепторным (хлороформ) эффектом, в парах с неполярными растворителями с одинаковым поверхностным натяжением. Это позволило выявить участие донорно-акцепторных механизмов в формировании адгезивных свойств бактерий, рассматривая его как функцию разности между сродством бактерий в парах к полярному и неполярному растворителям. Из таблицы видно, что поверхности бактерий, чувствительных и нечувствительных к варнерину штаммов стафилококков, обладают различными уровнями гидрофобности и донорно-акцепторных свойств; при этом выраженностью указанных характеристик обладают чувствительные к пептиду бактерии. Вместе с тем, выявленные закономерности требуют подтверждения увеличением массива экспериментальных данных.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что природа и особенности строения поверхностных соединений и структур бактерий, атакуемых низкомолекулярным катионным пептидом варнерином, во многом определяют эффективность его антибиотического действия. Чувствительные к варнерину штаммы стафилококков обладают более выраженной гидрофобностью поверхностей бактериальных клеток, что, благодаря

амфифильности самого пептида [6], значительно облегчает его сорбцию и проникновение сквозь клеточную стенку к мембране — мишени действия. В условиях сниженной гидрофобности поверхностных структур этому могут способствовать электро-но-акцепторные свойства бактериальных стенок.

Работа поддержана грантами РФФИ № 10-04-96086-р_урал_а, Программы Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология № 09-П-4-1019 и УрО РАН № 09-М-14-2002, 10-14-12-НАБ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Thwaite J.E., Laws T.R., Atkins T.P., Atkins H.S. Differential cell surface, properties of vegetative Bacillus // Lett. Appl. Microbiol. 2009. V. 48. P. 373-378.

2. Wadstrom Т. Molecular aspects on pathogenesis of wound and foreing body infections due to staphylococci // Zbl. Bacteriol. Hyg. A. 1987. V. 266. P. 191-211.

3. Cree R.G., Aleljung P., Paulsson M, Witte W, Noble W.C., Ljungh A., Wadstrom T. Cell surface hydrophobicity and adherence to extra-cellular matrix proteins in two collections of methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Epidemiol. Infect. 1994. V. 112. № 2. P. 307314.

4. Besnier J.M., Leport C., Vilde J.L., Pocidalo J.J. Effect of subinhibitory concentrations of antimicrobial agents on adherence to silicone and hydrophobicity of coagu-lase-negative staphylococci // Clin. Microbiol. Infect. 1996. V. 1. № 4. P.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком