ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 161-173
УДК 579.222
nß-ГИДРОКСИЛИРОВАНИЕ 21-АЦЕТАТА 6а-ФТОР-16а-МЕТИЛ-ДЕЗОКСИКОРТИКОСТЕРОНА МИЦЕЛИАЛЬНЫМИ ГРИБАМИ
© 2015 г. В. В. Коллеров, В. В. Фокина, Г. В. Суходольская, А. А. Шутов, М. В. Донова
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН Пущино Московской обл., 142290
e-mail: svkollerov@rambler.ru Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Протестированы 98 штаммов 31 рода мицелиальных грибов на наличие llß-гидроксилазной активности по отношению к 21-ацетату 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортикостерона. Установлено, что представители родов Gongronella, Scopulariopsis. Epicoccum и Curvularia обладали способностью осуществлять llß-гидроксилирование стероидов. Штаммы Curvularia lunata ВКМ F-644 и Gongronella butleri ВКМ F-1033 проявляли максимальную llß-гидроксилазную активность. Методами ТСХ и ВЭЖХ, а также масс-спектрометрического и 1Н ЯМР-спектроскопического анализа определены структуры основных продуктов и интермедиатов конверсии 21-ацетата 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортикостеро-на этими штаммами грибов. Показано, что пути образования 6а-фтор-16а-метил-кортикостерона штаммами С. lunata и G. butleri различались. Установлено, что ферментная система культуры G. butleri, катализирующая llß-гидроксилирование, является конститутивной и связана с мембраной. В то время как индуцибельная llß-гидроксилазная ферментная система С. lunata локализуется в микросо-мальной фракции. Показано, что в оптимальных условиях выход 6а-фтор-16а-метил-кортикостеро-на достигал 65% при концентрации 21-ацетата 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортикостерона 6 г/л.
Ключевые слова: llß-гидроксилирование, 21-ацетат 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортикостерона, мицелиальные грибы, 6а-фтор-16а-метил-кортикостерон, биотрансформация стероидов.
DOI: 10.7868/S0555109915020105
Поиск новых путей регио- и стерео-селективного гидроксилирования стероидов микроорганизмами, позволяющих решить одну из труднейших проблем органического синтеза — функцио-нализацию неактивных атомов углерода, остается важнейшим направлением исследований в области биоконверсии стероидов.
Микробиологическое 11р-гидроксилирование прегнанов, в частности, кортексолона и дезокси-кортикостерона, а также их производных широко используется при получении эффективных лекарственных препаратов, которые применяются в онкологии, дерматологии, ревматологии, пульмонологии и других областях медицины [1—3]. Особый интерес представляют 11р-гидроксипро-изводные кортикостероидов с функциональными заместителями, которые способны изменять как физико-химические свойства стероидов, так и их терапевтический эффект. Так, введение метиль-ной группы в 6а- или 16а-положение, а также фтора — в 9а- или 6а-положение усиливает противовоспалительную активность в 30—40 раз по сравнению с немодифицированными аналогами, а также снижает минералокортикоидную активность 11Р-гидроксилированных 3-кетостероидов [4].
Наличие в структуре стероидного ядра различных функциональных заместителей может влиять на регио- и стерео-специфичность микробного гидроксилирования. Присутствие 16а-метиль-ной группы в структуре молекулы кортексолона приводило к снижению 11а-гидроксилазной и блокированию 20ß-оксидоредуктазной активности мицелия Tieghemella hyalospora [5].
Показана способность осуществлять llß-гид-роксилирование стероидов у таких мицелиальных грибов, как Cunninghamella blakesleeana, Curvularia lunata, Mucor griseocyanus, Chephalothecium sp., Tri-chothecium sp., Botrytis cinerea, Coniotherium sp., Thamnidium sp., Rhodoseptoria sp., Colletotrichum sp., Dothichiza sp., Absidiaglauca, Pycnosporium sp. [6—9] и у некоторых видов рода Trichoderma [10]. Способность к введению гидроксильной группы в положение 11 ß молекулы дезоксикортикостерона (ДК) была показана только для штамма C. lunata [11]. В настоящее время сведения о проявлении микроорганизмами Hß-гидроксилазной активности по отношению к галогенированным и аце-тилированным производным ДК ограничены [12, 13]. Основная проблема практической реализации процессов микробиологического Hß-гид-
роксилирования 3-кетостероидов связана с образованием побочных продуктов, что осложняет процедуру очистки целевого продукта и приводит к снижению эффективности биотехнологического процесса [3]. В связи с этим необходим поиск новых продуцентов, обладающих высокой гид-роксилазной активностью и обеспечивающих селективность процесса.
Цель работы — исследовать llß-гидроксилаз-ную активность мицелиальных грибов различной таксономической принадлежности по отношению к 21-ацетату 6а-фтор-16а-метил-дезокси-кортикостерона, выявить наиболее активные штаммы и разработать эффективный метод получения 11 ß -гидроксипроизводных.
МЕТОДИКА
В работе использовали следующие реактивы: 21-ацетат 6а-фтор-16а-метил-дезоксикортеко-стерона (21 -ацетокси-прегн-4-ен- 3, 20-дион-21 -ол, ФМ-ДКА) ("Schering AG", Германия), кортек-солон (прегн-4-ен-17а,21-диол-3,20-дион), гидрокортизон (1^,17а,21-тригидроксипрегн-4-ен-3,20-дион) ("Sigma", США) и метилированное производное ß-циклодекстрина ("Wacker-Chemie GmbH", Германия). Остальные реактивы — российского производства.
Штаммы мицелиальных грибов были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН.
Культуры мицелиальных грибов выращивали на качалке при 220 об./мин и 29°C в течение 48 ч в 100 мл среды, рН 6.0—6.2, следующего состава (г/л дистиллированной воды): сахароза — 30.0, дрожжевой экстракт - 2.5, NaNO3 - 2.0, (NH4)2HPO4 - 3.0, KCl - 0.5, MgSO4 - 0.5, FeSO4 - 0.01, KH2PO4 - 27.2, K2HPO4 - 9.0. Посевной материал (10 об. %) переносили в свежую среду того же состава и инкубировали в течение 48 ч. Полученный мицелий отмывали 0.05 М калий-фосфатным буфером, рН 6.0, и использовали для трансформации. Трансформацию стероидов проводили на качалке при 220 об./мин и 29°C.
Получение внутриклеточных фракций дезинтегрированного мицелия Curvularia lunata и Gongronella butleri. Все стадии получения проводили при 0-4°C. Влажный мицелий (7 г) предварительно замораживали до -70°C, дезинтегрировали на прессе (ИБФМ РАН) и суспендировали в 60 мл 30 мМ калий-фосфатного буфера, рН 6.0-6.2, содержавшего 10 мМ ЭДТА, 2 мМ фенилметилсульфонил-фторид, 0.5 М сорбитол, 20%-ный глицерин и 0.2 мМ восстановленный глутатион. Гомогенат центрифугировали при 20000 g в течение 30 мин при
0°C. Полученный супернатант (бесклеточный экстракт) центрифугировали при 100000 g 90 мин [11].
Трансформация стероидов. Двухсуточный мицелий второй генерации (10 г сухой биомассы/л) промывали 0.05 М калий-фосфатным буфером, рН 6.0, помещали в колбы Эрленмейера объемом 750 мл в 100 мл 0.05 М калий-фосфатного буфера, рН 6.0-6.2, или 0.02 М раствора CH3COONa, рН 6.0-6.2. Затем вносили стероидный субстрат (1-6 г/л), растворенный в органических растворителях: метаноле, этаноле, ацетоне, диметилформа-миде (ДМФ), диметилсульфоксиде (ДМСО), конечная концентрация растворителей не превышала 4% об. Трансформацию проводили в течение 48120 ч.
Микронизированные частицы ФМ-ДКА со средним диаметром 2-5 микрон и числом полидисперсности 9 получали в течение 10 циклов на гомогенизаторе высокого давления при 100 МПа. Измерения проводили на фотонном корреляционном анализаторе частиц Photon-Corr "Nano-Sizer" ("Coulter", США).
Трансформацию субстрата фракциями дезинтегрированного мицелия проводили в конических колбах объемом 50 мл в 5 мл 0.1 М калий-фосфатного буфера, рН 6.0-6.1, содержащего 1 мМ НАДФН, 10 мкМ ФМН и 10 мкМ ФАД. ФМ-ДКА или кортексолон (0.25 г/л) вносили в виде раствора в метаноле (конечная концентрация метанола - 2 об. %).
Для анализа продуктов трансформации использовали методы ТСХ, колоночной хроматографии, ВЭЖХ, масс-спектрометрии и 1H ЯМР-спектро-скопии, как описано ранее [14].
Растворимость стероидов определяли по методу Хигуши [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Скрининг мицелиальных грибов. Известные в настоящее время данные о микробиологическом Hß-гидроксилировании кортикостероидов касаются, в основном, способности некоторых штаммов родов Curvularia, Cunninghamella и Absidia катализировать введение гидроксильной группы в молекулу кортексолона и его производных [16-20].
В настоящей работе было протестировано 98 штаммов мицелиальных грибов 31 рода на Hß-гидроксилазную активность по отношению к ФМ-ДКА (I, 1 г/л) (табл. 1). Эта активность была обнаружена у 33 штаммов, относящихся к родам Absidia, Colletotrichum, Cunninghamella, Curvularia, Epicoccum, Gongronella, Scopulariopsis и Tri-chotecium, для представителей родов Gongronella, Scopulariopsis и Epicoccum способность катализи-
Таблица 1. Трансформация OM-ДКА штаммами мицелиальных грибов
Штамм Конверсия OM-ДКА* 11 ß-OН производные*
Absidia coerulea В^ F-858 + +
В^ F-833 ++ +
ВKM F-834 ++ +
corrymbifera ВKM F-507 + +
ВKM F-513 + +
cuneospora ВKM F-784 - -
glauca ВKM F-514 ++ +
ВKM F-627 + +
ВKM F-628 + +
ВKM F-631 - -
ВKM F-1633 + +
spinosa ВKM F-967 - -
Aspergillus occhraceus ВKM F-68 - -
ВKM F-1982 + -
Backusella circina ВKM F-1475 - -
DS-34439 - -
DS-34440 - -
camprospora ВKM F-944 - -
Beauveria bassiana В^ F-2533 + -
felina ВKM F-3803 - -
Benjaminiella poitrasii ВKM F-1367 - -
Bipolaris australiensis ВKM F-835 - -
ВKM F-955 - -
ВKM F-3040 + -
cynodontis ВKM F-2326 - -
spicifera ВKM F-3281 - -
victoriae ВKM F-1445 - -
Bjekandera adusta ВKM F-3477 - -
Botrytis cinerea ВKM F-2163 - -
Colletotrichum muscae ВKM F-1184 + +
coccodes ВKM F-3612 + +
gloesporioides ВKM F-1185 - -
Cunninghamella echinulata ВKM F-439 ++ +
ВKM F-471 + +
ВKM F-531 + +
ВKM F-626 + +
ВKM F-657 ++ +
ВKM F-663 - -
ВKM F-678 + +
ВKM F-679 + +
ВKM F-775 + +
ВKM F-994 + +
japonica ВKM F-957 + +
ВKM F-995 + +
ВKM F-1205 ++ ++
ВKM F-1276 + +
Curvularia clavata ВKM F-3701 - -
comoriensis ВKM F-3039 - -
geniculata ВKM F-408 - -
ВKM F-958 - -
ВKM F-975 + -
ВKM F-3561 - -
Таблица 1. Окончание
Штамм Конверсия ФМ-ДКА* 11 ß-ОН производные*
ВКМ F-745 - -
inaegualis ВКМ F-22
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.