ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 429-434
УДК 577.152.3
ГИДРОЛИЗ ГЕПАРИНА ИММОБИЛИЗОВАННЫМ ФЕРМЕНТНЫМ КОМПЛЕКСОМ ИЗ Streptomyees kurssanovii
© 2004 г. Г. Е. Банникова*, П. П. Столбушкина**, Н. Н. Дрозд***, Г. А. Вихорева**, В. П. Варламов*, В. А. Макаров***, А. В. Панов****
* Центр "Биоинженерия" РАН, Москва, 117312; e-mail: varlamov@biengi.ac.ru ** Московский государственный текстильный университет, Москва, 119991 *** Гематологический научный центр РАМН, Москва, 125167 **** Российский химико-технологический университет, Москва, 125820 Поступила в редакцию 11.07.2003 г.
Показана возможность получения низкомолекулярных гепаринов с использованием иммобилизованного на силохроме ферментного хитинолитического комплекса из Streptomyees kurssanovii. Определены оптимальные условия процесса: Na-ацетатный буфер, рН 7-7.5, температура 40-45°C, продолжительность гидролиза 3 ч. В зависимости от соотношения гепарин/иммобилизованный ферментный комплекс были получены образцы с молекулярной массой от 1.7 до 4.7 кДа, обладающие ингибирующей фактор Ха активностью в 2.0-3.7 раз большей, чем у исходного гепарина.
Гепарин - мукополисахарид и антикоагулянт прямого действия, предотвращающий активацию свертывания крови млекопитающих как in vivo, так и in vitro. Его использование в клинической практике остается одним из основных элементов антитромботической профилактики и терапии.
Коммерческий нефракционированный гепарин (НФГ) физически и химически гетерогенен, содержание серы в нем составляет 9.5-11.5%, а молекулярная масса (ММ) изменяется в пределах от 3 до 40 кДа [1]. В последние годы было показано, что антикоагулянтное действие гепарина зависит от ММ полимера и низкомолекулярные ге-парины (НМГ) с более узким молекулярно-массо-вым распределением 4-6 кДа начали вытеснять нефракционированный гепарин как лекарственный препарат. Как НФГ, так и НМГ проявляют антикоагулянтное, в частности антитромботичес-кое действие, образуя комплекс с плазменным антитромбином. Но если комплекс НФГ-анти-тромбин в равной степени ингибирует ключевые ферменты каскада свертывания крови, такие се-риновые протеазы, как тромбин (фактор IIa) и фактор Ха, в меньшей степени другие ферментные факторы, то у НМГ преобладает анти-фак-тор Ха активность (аХа) [2, 3]. Однако не столь важно абсолютное значение активностей аХа и а11а, сколько их соотношение и у лучших коммерческих препаратов на основе НМГ оно составляет 2-4. Например, для тропарина (Австрия) это соотношение 1.5-2.5, а для кливарина или ревипа-рина натрия (Германия) 3.6-6.1 [4]. Чем выше этот показатель, тем более значителен антитром-ботический эффект и менее выражено геморрагическое действие препарата.
Известны разные способы получения НМГ. Фракционирование природного препарата обычно дает низкий выход целевой фракции. Более высокий выход может быть получен в ходе контролируемой деполимеризации гепарина [5]. Химическая деполимеризация в присутствии свободных радикалов позволяет получать НМГ и олигогепари-ны с ММ около 5 и 2 кДа соответственно [6]. Окислительно-восстановительный процесс в присутствии Ге2+ при 50°С за 20 ч приводит к образованию фрагментов гепарина с ММ около 3 кДа [7]. Обработка гепарина комплексом ЭДТА с ионами железа и аскорбиновой кислотой при 37°С за 24 ч с выходом 65% дает низкомолекулярные гепарины, содержащие менее 30 сахарных остатков, которые сохраняли антикоагулянтную активность [8].
К методам получения НМГ, минимально затрагивающим структуру молекулы, относятся гамма-излучение [9] и ферментативная деполимеризация. Для ферментативной деполимеризации обычно используют микробные гепариназы (гепарин-лиаза, КФ 4.2.2.7), специфически разрушающие а-глико-зидные связи между К-сульфатированным Б-глю-козамин-6-сульфатом и 2-О-сульфатом идуроно-вой кислоты [10, 11]. На основе частичной деполимеризации гепарина из слизистых оболочек свиньи с помощью гепариназы получают препарат логипарин [5]. Есть сведения о том, что НМГ, имеющие одинаковое молекулярно-массовое распределение, независимо от метода получения, оказывают одинаковое действие в биологических экспериментах [12]. Ранее нами была показана возможность ферментативной деполимеризации гепарина ферментным (хитинолитическим) комплесом (ФК) из Streptomyces кшззапоуи [13].
Цель работы - изучение возможности получения НМГ, обладающих преимущественно аХа-ак-тивностью, с использованием иммобилизованного на силохроме хитинолитического комплекса из S. kurssanovii.
МЕТОДИКА
В работе использовали натриевую соль гепарина (для инъекций) партия D0110001 Changzhou Quianhyong ("Bio-Pharm" Китай), силохром ВНИИ люминофоров (Россия), фр. 0.10-0.16 мм, диаметр пор 1260 А, 1,9-диметилметиленовый голубой фирмы "Aldrich" (США).
В качестве ФК использовали фильтрат культу-ральной жидкости S. kurssanovii с содержанием белка 0.2 мг/мл и хитиназной активностью 0.4 ед/мл, полученной, как описано в работе [14]. Содержание белка определяли спектрофотометрическим методом по связыванию с красителем Кумасси ярко-голубым G-250 [15].
Хитиназную активность рассчитывали по количеству восстанавливающих сахаров в реакции с 3,5-динитросалициловой кислотой, используя в качестве субстрата коллоидный хитин. За 1 единицу активности принимали количество мкмолей N-аце-тилглюкозамина, образующегося за 1 мин под действием 1 мл ферментного комплекса в стандартных условиях (0.1 М фосфатный буфер, рН 6.4, 37°C, 15 мин).
Получение иммобилизованного ферментного комплекса (ИФК) осуществляли по методике [16]. Для этого к 1 г аминоарильного производного силохрома добавляли 20 мл 2.5 н. HCl и 3.0 мл 14%-ного раствора NaN02 при охлаждении (4°C), перемешивали в течение 30 мин, промывали на стеклянном пористом фильтре водой (200 мл), 0.1 М фосфатным буфером, рН 7.8 (100 мл), переносили в колбу и добавляли 15 мл ФК S. kurssanovii и перемешивали 16 ч при 4°C. Иммобилизованный ферментный комплекс промывали на стеклянном пористом фильтре водой (200 мл), 1М NaCl (200 мл) и вновь водой. Хранили в холодильнике во влажном состоянии.
Процесс деполимеризации гепарина исследовали по методике [17]. К 4 мл 0.5%-ного раствора гепарина в 0.1 М Na-ацетатном буфере, рН 7.0, добавляли 50 мг ИФК и перемешивали на качалке при 45°C 3 ч. Периодически отбирали пробы по 0.1 мл, добавляли 2.5 мл раствора 1.9-диметил-метиленового голубого и определяли изменение поглощения при 525 нм на спектроколориметре "Specol 11" (Германия). Гидролиз проводили, используя 1%-ные растворы гепарина в 0.1 М ацетатном буфере с рН от 4.0 до 7.5, при температуре 30-50 °C в течение 0.5-4 ч с перемешиванием. Соотношение гепарин-ИФК (по массе) составляло 1 : 0.5-1 : 3. После гидролиза ИФК отделяли цен-
трифугированием, промывали 0.5 M NaCI и водой. Полученные растворы присоединяли к су-пернатанту, обессоливали на колонке с сефадек-сом G-10 (2.5 х 42 см, элюент - вода, скорость элюции - 80 мл/ч) и лиофильно высушивали.
Характеристическую вязкость образцов гепарина рассчитывали по приведенной вязкости, определенной в вискозиметре Уббелоде (диаметр капилляра 0.4 мм) при 25 ± 0.5°C, путем последовательного разбавления. Начальная и конечная концентрация растворов 0.5 и 1.5 дл/г. В качестве растворителя использовали 0.1 M NaCl. Средне-вязкостную MM рассчитывали по формуле:
[П] = 1.75 х 10-5 х MM098 [18]. (1)
Содержание серы определяли на элементном анализаторе ЕА-1108, "Карла-Эрба" (Италия). Спектры 13C-üMP растворов с концентрацией 0.2 г/мл записывали в дейтерированной воде на спектрометре ЯMP "Bruker WP-200" (Германия) с рабочей частотой на ядре ХН - 200 MÉ^
Для определения антитромбиновой и ингиби-рующей фактор Ха активностей конкретного образца готовили серии растворов с несколькими разведениями и растворы стандарта HMÉ. Строили зависимость изменения поглощения от логарифма концентрации исследуемых растворов антикоагулянта и сопоставляли со стандартными растворами HMÉ. Далее выбирали зависимость, имеющую линейное соответствие со стандартом, и определяли степень разведения антикоагулянта, соответствующую международным единицам, с использованием стандартных статистических методов анализа.
Для оценки удельной антитромбиновой (alla) активности (ед./мг) 250 мкл антитромбина фирмы "Behring" (Германия) (1 ед./мл 0.05 M трис-HCl буфера с 0.0075 M №2-ЭДТА и 0.175 M NaCl, рН 8.4) инкубировали 3 мин при 37°С с образцами гепарина разной MM. Затем добавляли 100 мкл раствора бычьего тромбина фирмы "Behring" (2 ед./мл трис-ЭДТА буфера). Через 30 сек добавляли 200 мкл раствора (2 hM трис-ЭДТА буфер) хромогенного субстрата для тромбина - S-2238, фирмы "Behring". Определяли изменение поглощения раствора за 1 мин при 405 нм. Для построения калибровочной кривой использовали растворы НФГ фирмы "Sigma" (США) (alla 154 ед./мг) в трис-ЭДТА буфере с активностью антикоагулянта от 0.1 до 1.0 а11а ед./мл [19].
Для определения удельной аХа активности к 250 мкл антитромбина фирмы "Behring" (1 ед./мл 0.05 M трис-ЭДТА буфера с 0.0075 M №2-ЭДТА и 0.175 M NaCl, рН 8.4) добавляли гепарин разной концентрации и 250 мкл смеси фактора Ха той же фирмы (8 ед./мл трис-ЭДТА буфера) с сульфатом декстрана (0.02 мг/мл) фирмы "Boehringer Man-hame" (Австрия). Инкубировали 3 мин при 37°С,
^525
Рис. 1. Изменение поглощения растворов комплекса гепарина с диметилметиленовым голубым в ходе гидролиза гепарина ИФК.
T, °C
pH
Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости (дл/г) растворов гепарина от рН среды (1) и температуры гидролиза (2).
определяли остаточную активность фактора Ха, добавляя 50 мкл 4 мМ водного раствора хромо-генного субстрата - S 2222 фирмы "Behring" . Активность определяли по изменению поглощения при 405 нм. Для калибровочной кривой использовали растворы НМГ фирмы "Sigma" (aXa 90 ед./мг) в трис-ЭДТА буфере с активностью антикоагулянта от 0.1 до 1.0 аХа ед./мл [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что различные гидролазы: гемицел-люлазы, лизоцим, папаин, глюканазы, липазы, протеазы могут расщеплять гликозидные связи [21, 22], поэтому возможен гидролиз гепарина ферментным комплексом S. kurssanovii, содержащим О-гликозид
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.