ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 4, с. 435-441
УДК 615.31:547.466.
ГИДРОЛИЗ ПЕПТИДОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ БАКТЕРИАЛЬНЫМИ ПЕПТИД-ГИДРОЛАЗАМИ
© 2004 г. А. Д. Неклюдов, Е. К. Денякина
Московский государственный университет леса, г. Мытищи, Московская область, 141001
e. mail: aivankin@mgul.ac.ru Поступила в редакцию 29.05.2003 г.
Изучена возможность использования для гидролиза смеси пептидов фермента из бактерий Xanthomo-nas rubrilineans с пептидазной активностью, иммобилизованного на оксиде алюминия. Представлены кинетические схемы и уравнения, позволяющие приблизиться к количественному описанию процесса гидролиза пептидов в сложных смесях, содержащих свободные аминокислоты и пептиды. Показано, что в результате гидролиза удается увеличить в 2.5-3 раза содержание свободных аминокислот в гид-ролизатах и уменьшить в 2 раза молекулярную массу входящих в их состав пептидов.
В последние несколько лет в связи с развитием генной инженерии и приготовлением специальных сред для культивирования органов и тканей, вновь проявился интерес исследователей к получению растворов аминокислот и низкомолекулярных пептидов, о чем подробно обсуждалось в обзорах и монографиях, недавно вышедших из печати [1-4]. В настоящее время подобные смеси выпускаются отечественной промышленностью, но имеют, как правило, недостаточное количество свободных аминокислот и избыточное количество пептидов, содержащих свыше 4-8 аминокислотных остатков в своих молекулах. Очевидно, используя эти смеси в качестве сырья и имея подходящий способ для улучшения их состава, можно попытаться получить растворы требуемого качества. Кроме того, для контроля процесса и сравнения эффективности тех или иных режимов расщепления пептидов в таких сложных смесях, представлялось интересным попытаться количественно описать процесс гидролиза с помощью определенных кинетических схем и уравнений. Следует отметить, что в доступной нам литературе подобный подход к решению данной задачи практически отсутствовал как для водорастворимых ферментных препаратов, так и для их иммобилизованных форм.
Ранее уже упоминалось о том, что иммобилизованные ферменты наиболее рационально использовать для гидролиза 3-6%-ных растворов пептидных фрагментов белков [1, 2, 5]. Именно эту возможность мы и попытались реализовать в нашем исследовании.
Цель работы - изучение возможности использования пептидазы из рода ХапгНотопаз тыЪтШпв-апз для обогащения гидролизатов свободными аминокислотами и разработка количественного описания этого процесса.
МЕТОДИКА
В работе использовали соли, кислоты, гидро-ксиды и другие реактивы отечественного производства квалификации ч.д.а. или х.ч.
Объектом исследования была выбрана смесь, содержащая не менее 60% пептидов, полученная в результате высушивания на распылительной сушилке 5%-ного раствора гидролизата казеина для парентерального питания, выпускаемого Сергиев-Посадским гормолзаводом.
В качестве ферментного препарата использовали водорастворимый фермент с пептидазной активностью (КФ 3.4.13.1.) из бактерий ХаШото-паз гыЫШтаз ВКМ-В-629 из коллекции Государственного научного центра по антибиотикам. Ферментный препарат содержал не менее 70% активного белка, а также КаС1 и наполнители и имел, по данным электрофореза, в 18%-ном поли-акриламидном геле молекулярную массу ~70 кДа, изоэлектрическую точку 7.6, рН-оптимум при 6.5 [6, 7] и пептидазную активность, определенную по гидролизу п-нитроанилида-Ь-лейцина [6, 8] -не менее 40 ед./г.
Ферментный препарат с пептидазной активностью (ФППА) был иммобилизован на оксиде алюминия по методу, описанному в работах [9, 10].
Активность иммобилизованного ферментного препарата (ИФП) выражали в мкмолях свободных аминогрупп, освобождающихся в течение 1 ч, и отнесенных на 1 г ИФП.
Для исследования стабильности ИФП его инкубировали при температуре от 30 до 60°С и определяли изменение активности фермента во времени, что позволило рассчитать константы инактивации и долю стабильной и лабильной фракций ИФП.
Получали 1-10%-ные растворы пептидов гидролизата казеина растворением соответствую-
435
4*
1 2
3
(а)
2.34
3.16
1.40 1.45 х о
2.02.12 X
2.42
.X
2
2.3
2.5 *
36
30
24
18
0
Рис. 1. Рентгенограммы исходного (а) и обработанного трилоном Б и соляной кислотой (б) оксида алюминия: 1 - у-АЮ(ОН), 2 - у-А1203, 3 - а-А1203. Цифры указывают величину интенсивности пиков. Разрешение 2.1 х 10-10 м.
щих аликвот сухого препарата в дистиллированной воде. Гидролиз пептидов в полученных растворах проводили в проточно-циркуляционной системе в колоночном реакторе высотой 0.5 м и диаметром 4 см при скорости пропускания раствора 85-90 мл/ч, обеспечивающей кинетический режим процесса. Степень гидролиза контролировали спектрофотометрически по увеличению сводных аминогрупп реакцией в растворе с три-нитробензолсульфокислотой (ТНБС), а также по степени увеличения содержания свободных аминокислот в исследуемом гидролизате [11].
Аминокислотный анализ проводили на аминокислотном анализаторе ЬС-3000 фирмы "Еррепёог1-ВюЦотс" (Германия) по стандартным программам.
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли по методу наименьших квадратов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Работа была начата с исследования структуры носителя, выбранного для иммобилизации. Из литературы известно, что оксид алюминия для хроматографии, обычно получаемый из бокситов, имеет основную общую формулу А1203(Н20)„ и содержит целый ряд кристаллических и других примесных модификаций: диаспор - НА102, бежит - А10(0Н) , гидроаргилит - А1(0Н)2 и др. Кроме того, как известно, в высокотемпературных процессах распада примеси гидроксида алюминия происходит диссоциация по схеме:
А1(0Н)3
А120
2^3
А10+ + А102
Оба эти иона при взаимодействии с водой образуют бежит [12, 13].
В связи с этим представляло определенный интерес изучить те изменения, которые происходят с выбранным носителем в процессе его общепринятой предварительной активации [9, 10].
Рентгеноструктурный анализ носителя при разрешении 2.1 х 10-10 м (2.1 А) показал, что в исходном оксиде алюминия присутствовали кристаллические фазы 3 типов: у-А1203, составляющий основную кристаллическую фазу, у-А10(0Н), и небольшое количество а-А1203 (рис. 1). Обработка носителя трилоном Б и 10%-ной соляной кислотой, которую обычно проводили при иммобилизации на этом носителе других ферментов для удаления примесей переходных металлов [14, 15], приводила к вымыванию кристаллов у-АЮ(0Н) [16], которые, на наш взгляд, наиболее легко реагируют за счет реакции переэтерефикации с у-амино-пропилтриэтоксисиланом (у-АПТЭС), используемым для активации носителя. Следовательно, при вышеназванной реакции, во-первых, происходило уменьшение количества реакционных групп, подверженных в дальнейшем обработке у-АПТЭС, во-вторых, на поверхности носителя образовывались поры с диаметром до 100 мкм, что увеличивало адсорбционную способность носителя по отношению к белку.
Как показали результаты, присутствие в ИФП адсорбированного, химически не связанного с носителем белка нежелательно, так как в процессе эксплуатации ИФП такой белок десорбируется с поверхности носителя, что приводит к загрязнению белком конечного продукта. В связи с этим в дальнейшем было решено отказаться от обработки оксида алюминия трилоном Б и соляной кислотой и остановиться только на его обработке горячим паром. Контрольные опыты показали, что в этом случае весь белок в ИФП фиксирован на поверхности носителя ковалентными связями.
Для получения ИФП с высокой активностью и стабильностью проводили оптимизацию условий иммобилизации ферментного препарата по трем факторам: концентрация глутарового альдегида (ГА), содержание аминогрупп на носителе и количество белка, взятого для иммобилизации на 1 г носителя. Для расчетов было решено принять линейное описание функции отклика.
Предварительное исследование показало, что ИФП можно условно считать состоящим из 2 различающихся по стабильности фракций: лабильной и стабильной. При изменении условий иммобилизации в широких пределах константа инактивации стабильной фракции ИФП изменялась незначительно, а вклад лабильной фракции во время безотказной работы и сохранения активности ИФП был пренебрежительно мал. В связи с этим в качестве параметра оптимизации выбрали
]
активность стабильной фракции. Как показали исследования, эта величина зависит от сохранения активности ферментного препарата при иммобилизации и от выхода стабильной фракции.
Иммобилизация ФППА на оксиде алюминия, как известно [17], происходит в 3 этапа: 1 - обработка поверхности носителя у-АПТЭС; 2 - обработка носителя, подвергнутого действию у-АПТЭС, глу-таровым альдегидом (ГА); 3 - иммобилизация ФППА на активированном носителе.
Оптимизация параметров иммобилизации проводилась по методу Бокса-Уилсона [18]. В результате оптимизации были найдены следующие оптимальные параметры процесса: концентрация ГА - 3%, содержание аминогрупп на носителе -65 ± 5 мкмоль/г; количество белка, оптимальное для проведения процесса иммобилизации, на 1 г носителя - 2.65 ± 0.05 мг [10, 11]. В этих условиях ИФП получали в количествах до 1 кг, причем результаты воспроизводились от партии к партии. Полученный биокатализатор имел следующие характеристики: суммарная пептидазная активность при 40°С, определенная по п-нитроанилиду лейцина, - 28.8 ± 0.6 ед./г, концентрация белка на носителе - 0.56 ± 0.05 мг/ г. Остаточная активность после иммобилизации составляла не менее 72%.
Полученный по вышеприведенному методу ИФП мог храниться при 3-5°С без потери активности в течение нескольких месяцев.
В результате иммобилизации значительно повышалась температурная стабильность ФППА. Так, константа инактивации водорастворимого ферментного препарата, кин, равнялась 1.01 ± 0.08 ч-1, время "безотказной работы" - то = 1 ч при 40°С. При 45°С эти характеристики были равны соответственно 3.3 ± 0.2 ч-1 и 0.3 ч. Для ИФП при 40°С
константа инактивации лабильной фракции, к и^ = = 0.82 ± 0.20 ч-1, стабильной ки2н) = (0.83 ± 0.03) х х 10-3 ч-1, т0 = 516 ч; при 45°С к^ = 0.90 ± 0.25 ч-1, кин = (6.00 ± 0.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.